朱軍燕，李煥梅，王硯妮，龍 同，高 娃，趙 筱，趙錦芳

（1.湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

硒是人體所必需的一種微量元素，具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)人體免疫等生物學(xué)活性。缺硒可能導(dǎo)致心肌梗塞等疾病，與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒吸收利用率高、營養(yǎng)價值好、使用安全、無毒副作用，是補(bǔ)硒的首選。近年來，通過微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)有機(jī)硒研究取得了較快發(fā)展，富硒發(fā)酵工藝條件已趨成熟。目前在富硒微生物的研究中，酵母通常作為首選載體。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一種革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，能利用葡萄糖產(chǎn)生50% 以上的乳酸，是能產(chǎn)生乳酸的一類細(xì)菌的總稱。在自然界中種類繁多，分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌有43 個屬，包括373 個種和亞種［1］。作為益生菌中的一個類群，乳酸菌被廣泛應(yīng)用于食品、輕工、醫(yī)藥及飼料工業(yè)等許多行業(yè)。近年來，富硒乳酸菌因?yàn)槠渫怀龅目寡趸?、抑菌、抗癌及抗突變等特性，受到學(xué)者的普遍關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，作為一種元素富集型益生菌，許多乳酸菌能夠吸附無機(jī)硒并將其生物轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒［2-4］。現(xiàn)已報道的具有富硒能力的乳酸菌主要集中于乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和乳球菌屬（Lactococcus）。本文對不同乳酸菌液體富硒發(fā)酵研究的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為富硒乳酸菌的選育和開發(fā)利用提供理論支撐。

1 乳桿菌屬

已報道的具有富硒作用的乳桿菌很多，如鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）［5］、保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus）［6］、布氏乳桿菌（L. buchneri）［7］、羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）［8，9］、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）［9］、干酪乳桿菌（L. casei）［10］、短乳桿菌（L. brevis）［11］、植物乳桿菌（L. plantarum）、副干酪乳桿菌（L. paracasei）、類布氏乳桿菌（L. parabuchneri）［12］等。

1995 年，Calomme 等［13］對3 株乳酸菌進(jìn)行富硒培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中硒濃度為1 mg/L 時，德氏乳桿菌保加利亞亞種（L. delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC 11842）、植物乳桿菌（L. plantarum ATCC 14917）和干酪乳桿菌干酪亞種（L. casei subsp. casei ATCC e393）3 株菌的富硒量分別為253、375、407 μg/g 干菌體，這是乳桿菌對硒具有富集作用的首次報道。

汪波等［14］對嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌3 株乳酸菌進(jìn)行了耐硒能力比較，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌耐硒能力最強(qiáng)，當(dāng)含硒量為17 μg/mL 時，37 ℃下培養(yǎng)9 h，富硒率達(dá)到65.4%。

Saini 等［15］對25 株乳酸菌進(jìn)行了耐硒、富硒能力試驗(yàn)，在MRS 培養(yǎng)基中添加10 μg/mL 亞硒酸鈉，37℃發(fā)酵24 h 后，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP）測定總硒含量，其中2 株乳桿菌（L. reuteri NCDC77 和L. reuteri LB2 DSMZ）富硒量最高，分別為820.0、742.5 μg/g。

M?rschb?cher 等［12］對尼泊金乳酸桿菌［L. parabuchneri（ML4）］、副干酪乳桿菌［L. paracasei（ML13、ML33、CH135 和CH139）］、植物乳桿菌［L. plantarum（CH131）］和 糞 腸 球 菌［Enterococcus faecalis（CH121 和CH124）］8 株乳酸菌富硒能力進(jìn)行研究，在硒濃度為150 mg/L 時，L. paracasei ML13 和L. paracasei CH135 的富硒量最高，分別為38.1、40.7 mg/g。其他幾種乳桿菌富硒發(fā)酵條件見表1。

表1 富硒乳桿菌發(fā)酵條件

2 鏈球菌屬

2004 年，宋照軍等［23］從酸奶中分離純化出嗜熱鏈球菌，通過濃度梯度法進(jìn)行耐硒馴化后，采用番茄酵母培養(yǎng)基，接種量10%，培養(yǎng)溫度39 ℃，pH 7，第6 天加硒，硒濃度為15 μg/mL，培養(yǎng)11 h，富硒率為72.8%。隨后，孫林超［24］采用同樣的方法獲得嗜熱鏈球菌，利用番茄酵母培養(yǎng)基，加硒時間為第5 天，硒濃度為16 μg/mL，接種量為10%，培養(yǎng)時間為10 h，培養(yǎng)溫度為39 ℃，pH 為7，富硒率為71.6%。

此外，黃秀錦［25］用乳酸菌發(fā)酵劑（M）（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）水解脫脂乳培養(yǎng)基，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH 6.6，亞硒酸鈉濃度為18 μg/mL，裝液量為150 mL/250 mL 三角瓶，接種量5.5%，培養(yǎng)溫度42 ℃，培養(yǎng)時間45.5 h。在此優(yōu)化條件下，富硒乳酸菌生物量可達(dá)6.85 g/L，細(xì)胞硒含量達(dá)1 100 μg/g，硒總含量可達(dá)7 536 μg/L，細(xì)胞硒含量的92.15% 為有機(jī)硒。

張慶慶等［26］采用紫外-氯化鋰誘變法對嗜熱鏈球菌進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選得到1 株高富硒率的嗜熱鏈球菌突變株ZZ-CW4，富硒率高達(dá)83.43%。

有研究者通過誘變、馴化等手段，篩選并獲得硒多糖高產(chǎn)嗜熱鏈球菌菌株，通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，建立嗜熱鏈球菌胞外含硒多糖的合成新工藝，并開發(fā)出高生物硒含量的混合菌株制劑［27-29］。

楊鶴［30］研究了5 種乳酸菌單菌和復(fù)合菌富硒能力及條件，在MRS 培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉濃度為6 μg/mL，1% 接種量，37℃條件下培養(yǎng)，發(fā)酵至36 h時，嗜酸乳桿菌08001 與植物乳桿菌富硒轉(zhuǎn)換率分別為66.37% 和55.81%，嗜熱鏈球菌3.3 富硒轉(zhuǎn)換率在60 h 最高，達(dá)66.09%。嗜熱鏈球菌3.3 與保加利亞乳桿菌L5 的復(fù)合菌的富硒能力較好，在60 h時達(dá)到最大值70.44%，嗜熱鏈球菌3.3 與保加利亞乳桿菌L9 在60 h 的富硒轉(zhuǎn)換率為50.08%。通過研究證實(shí)，添加2% NaCl 可以使嗜酸乳桿菌08001的富硒能力提高到70.51%。

近幾年，Yang 等［31］對乳酸菌富硒發(fā)酵進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，在不同條件下用德式乳桿菌亞種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行富硒培養(yǎng)，使用響應(yīng)面方法優(yōu)化Se 富集的初始pH、接種量和溫度。結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適初始pH、接種量和溫度分別為5.96、6.73%、33 ℃和6.37、6.00%、40 ℃，保加利亞乳桿菌對硒的富集率達(dá)94.34%，嗜熱鏈球菌則達(dá)97.05%。隨后又研究了2 株乳酸菌L. delbrueckii ssp. Bulgaricus XN-L 和S. thermophilus XN-S 的抗菌活性，通過平板菌落計數(shù)法確定適合菌株生長的亞硒酸鈉濃度為80 μg/mL，富硒乳酸菌XN-L 和XN-S 富硒量分別為12.05、11.56 μg/mL［32，33］。此外，通過對13 株乳酸菌的富硒能力和生物活性進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌L. plantarum WY3 耐硒質(zhì)量濃度最高，為100 μg/mL，嗜熱鏈球菌S. thermophilus WY12 的富硒率最高，為79.19%［34］。

2019 年，Casta?eda-ovando 等［35］在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌在絲氨酸存在的條件下可以將亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸。

3 腸球菌屬

宋拓等［36］研究了富硒乳酸糞腸球菌（E. faecalis）微膠囊包埋工藝，獲得產(chǎn)品率為82.68%，包埋后菌體存活率為72.15%，菌體硒含量為0.571 mg/g。包玉清等［37］對乳酸糞腸球菌最佳發(fā)酵產(chǎn)量和富硒量條件進(jìn)行研究，硒添加量35 mg/L、接種量10%、發(fā)酵時間28 h、pH 4.5～6.3，經(jīng)發(fā)酵獲得的菌體產(chǎn)量為404.10 mg/100 mL，干物質(zhì)產(chǎn)量683.14 mg/100 mL，菌體富硒量248.56 μg/100 mL，干物質(zhì)富硒量393.21 μg/100 mL，發(fā)酵液環(huán)境硒量31.07 mg/L，干物質(zhì)非有機(jī)硒量147.65 μg/100 mL。

2011 年，Pieniz 等［38］分離鑒定了36 株具有硒吸附能力的乳酸菌，其中E. faecalis LAB 14 和E.faecium LAB 18 對硒吸附能力最強(qiáng)，富硒量分別為475.9、459.9 μg/g。2013 年，該研究組又分離出1 株性狀優(yōu)良的耐久腸球菌E. durans LAB18s，發(fā)酵用腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI），初始添加240 mg/L 亞硒酸鈉，在pH 為7.0，溫度30℃發(fā)酵24 h，其富硒量最大可達(dá)176.97 mg/g 干菌體［39］。2017 年，他們又研究分析了E. durans LAB18s 生物量中有機(jī)硒的分布，發(fā)現(xiàn)總蛋白中有機(jī)硒含量最高，其次是多糖和核酸。采用不同提取方法得到的蛋白質(zhì)組分中，堿溶性蛋白質(zhì)的硒含量較高［40］。

2018 年，M?rschb?cher 等［12］研究了包括糞腸球菌［Enterococcus faecalis（CH121 和CH124）］在內(nèi)的8 株乳酸菌的富硒能力，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加30 mg/L 或60 mg/L 亞 硒 酸 鈉，E. faecalis CH121 和CH124 的富硒能力均很弱，僅為0.7 mg/g，菌體生物量也僅能達(dá)到23% 和17%。

2019 年，董曉芬等［41］篩選獲得1 株富硒能力強(qiáng)且適宜發(fā)酵枳椇液的屎腸球菌E. faecium，在接種量為1%（v/v）、亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL、36 ℃培養(yǎng)24 h 條件下，富硒率達(dá)39.06%。

4 乳球菌屬

齊睿婷等［42］對乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. Lactis LQ-12）富硒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用BLX 培養(yǎng)基，當(dāng)接種量8% 時，培養(yǎng)24 h，亞硒酸鈉濃度為14 μg/mL，溫度37 ℃，pH 6.6 時，乳酸乳球菌的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為59.87%。2015 年，Pusztahelyi等［43］篩選獲得4 株高耐受硒的突變株Enterococcus faecium W54、Bifidobacterium animalis ssp. Lactis BB12、Lactobacillus casei 431 和Lactococcus lactis ssp.Lactis R703。在MRS 培養(yǎng)基中添加不同濃度NaHSeO3發(fā)酵后，各菌株富硒量均很高，E. faecium W54為54 362 mg/kg，L. casei 431 為37 428 mg/kg，R703為64 726 mg/kg，表現(xiàn)出很好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

此外，李艷嬌等［44］從泡菜中分離出活力強(qiáng)的乳酸菌，發(fā)酵有機(jī)米糠富集亞硒酸鈉。最佳發(fā)酵條件為有機(jī)米糠添加量34 g、培養(yǎng)基裝液量55 mL、接種量9%、種 齡8～16 h、發(fā) 酵 時 間48 h、發(fā) 酵 溫 度37 ℃、亞硒酸鈉添加量100 mg/L；經(jīng)發(fā)酵乳酸菌的生物量可達(dá)9.94 g/L，有機(jī)硒的生產(chǎn)水平為7.46 mg/L。胡惠影等［45］對高富硒乳酸菌進(jìn)行篩選研究，采用MRS 培養(yǎng)基，5% 接種量，培養(yǎng)溫度37 ℃，適宜加硒時間為培養(yǎng)后8 h，培養(yǎng)時間為24 h，硒濃度為10 μg/mL 時，菌株JZ-07 富集轉(zhuǎn)化硒能力最強(qiáng)，富硒量達(dá)19 413 μg/g 干菌體，轉(zhuǎn)化率為89.00%。

5 小結(jié)

富硒益生菌產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為研究熱點(diǎn)。酵母是目前公認(rèn)的有機(jī)硒富集最佳載體，而乳酸菌因其良好的風(fēng)味和保健功能，已成為有機(jī)硒的一個新型來源。目前國內(nèi)外對乳酸菌在抗氧化、抗菌及抗癌等領(lǐng)域的研究報道很多，關(guān)于其富硒發(fā)酵研究也日趨成熟，主要集中于富硒菌株的篩選（耐硒菌株的馴化、誘變）和培養(yǎng)條件優(yōu)化（培養(yǎng)基、初始pH、溫度、發(fā)酵時間、接種量、硒添加量、加硒方式等），以獲得高富硒量和高生物量為目標(biāo)。隨著乳酸菌后基因組時代的到來，不同種屬乳酸菌的硒代謝途徑及控制機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究，以期為富硒益生菌的開發(fā)提供參考和借鑒。