祖超，李蓉蓉，李志剛，王燦，魚歡，鄭維全，楊建峰

(1.中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所， 海南 萬寧 571533； 2.農業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室， 海南 萬寧 571533；3.海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室， 海南 萬寧 571533)

香辛料之王胡椒，種子繁殖非生產期較長，生產中一般采用扦插繁殖，插條苗培育1個月后即可開花結果，導致胡椒整個生命周期都在開花結果。嚴格來說胡椒營養(yǎng)生長與生殖生長時期界限不明顯，造成了胡椒生殖生長和營養(yǎng)生長爭奪養(yǎng)分，在非主花期抽穗開花浪費樹體養(yǎng)分。不僅胡椒，咖啡、龍眼、芒果等熱帶植物都存在周年開花結果現(xiàn)象，因此，探明調控胡椒花穗抽生脫落的關鍵生理過程，減少非主花期花量，增加主花期花量，對胡椒產業(yè)乃至整個熱作產業(yè)產量生理學過程的研究具有重要意義。胡椒原產于印度西高止山脈熱帶雨林區(qū)，是多年生常綠耐蔭藤本植物[1]，根據(jù)耐蔭特性，以及光合產物和植物激素是調控花量的重要內部信號[2-3]，前人研究多集中于改變光強調控葉片光合產物和激素含量，進而增加或降低胡椒花穗數(shù)目，研究發(fā)現(xiàn)改變胡椒生長環(huán)境的光強，可以通過調控光合產物含量進而影響胡椒花穗數(shù)目[4]、產量和品質[1]，通過間作遮蔭可以提升葉片光合作用能力，這對產量的貢獻率達52%[5]；光強還可以改變葉片內源赤霉素含量影響胡椒花穗數(shù)目[6]，除了赤霉素，脫落酸也會影響植物成花，重度遮蔭也可以降低ABA/IAA和ABA/GA3不利于郁金香成花[7]。前期研究主要集中于光強可以改變葉片光合產物含量和激素含量調控胡椒花穗數(shù)目和產量，但是，光強過高或過低時，胡椒源葉應答光脅迫的關鍵光合作用參數(shù)和激素指標尚不清楚。本研究在已有研究基礎上進一步探明光強調控源葉光合作用和激素含量對胡椒花穗抽生、脫落、成穗影響的關鍵生理過程，這對補充熱帶作物產量生理學過程研究，以及在生產中采用植物生長調節(jié)劑調控花量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試材一：以在沙床培養(yǎng)1個月，長勢一致的胡椒插條苗為試材。

試材二：以中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所的胡椒試驗示范基地 (18°1′N，110°13′E)內的2齡熱引1號(PipernigrumL.cv.Reyin No.1)幼齡胡椒為試材。其中葉片形態(tài)、光合生理、碳代謝相關參數(shù)選取花所在葉位下一葉位的完全穩(wěn)定葉，即倒二葉為試材[1]。該區(qū)域年均溫24.6 ℃左右，日照時數(shù)1 804～2 300 h，年均降水量約2 164 mm。

1.2 方法

1.2.1 室內光強模擬試驗方法 試驗選用福建九圃生物科技有限公司提供的智能補光系統(tǒng)(JIUPO-1WSLED-210)，設置405 μmol·m-2·s-1和270 μmol·m-2·s-12個試驗處理，8個生物學重復，光照時間為12 h/12 h，晝夜溫度為28 ℃，插條苗采用石英砂栽培，澆灌營養(yǎng)液的方法，營養(yǎng)液組成(μmol·L-1)：75 K2SO4、65 MgSO4·7H2O、10 KCl、25 KH2PO4、1 MnSO4·H2O、1 ZnSO4·7H2O、1 CuSO4·5H2O、5(NH4)6MO7O24·4H2O、1 H3BO3、100 FeSO4·7H2O、100 Na2-EDTA、2 000 Ca(NO3)2·4H2O，培養(yǎng)時間為70 d。

1.2.2 田間原位遮蔭試驗方法 此研究在2017年8月—2019年7月進行，試驗于8月上旬開始，設置全光照和遮蔭2個處理，主花期(9—11月)，全光照處理日均光合有效輻射(9:00—16:30)為322 μmol·m-2·s-1，日均最大光合有效輻射為1 110 μmol· m-2·s-1，遮蔭處理選用遮陽網遮蔭，日均光合有效輻射為137 μmol· m-2·s-1，日均最大光合有效輻射為335 μmol·m-2·s-1。每個處理選取 3 株長勢基本一致的植株，每株作為1個重復。種植園胡椒株行距為 2 m×2.5 m，植株高約1.5 m，冠幅約1.4 m，東西走向。

1.2.3 花穗數(shù)目測定 田間原位試驗，每個處理選取3株長勢一致的胡椒，在主花期統(tǒng)計花穗數(shù)目，在果熟期統(tǒng)計果穗數(shù)目，差值即為脫落數(shù)，室內采用掛牌方法統(tǒng)計花穗抽生、脫落數(shù)目。

1.2.4 光合參數(shù)測定 在花穗抽生長至穩(wěn)定后用LI6400型便攜式光合儀(LI-6400,LI-COR,Lincoln,NE,USA)測定胡椒花穗所在葉位下一葉位完全展開葉 9:00—11:30 時的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)。

1.2.5 胡椒源葉激素含量測定 本試驗采用高效液相色譜法(HPLC)測定生長素(IAA)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)。3種激素的提取方法：稱取約0.1 g新鮮植物葉片，放入研缽中磨碎，加入1 mL預冷的甲醇，4 ℃浸取過夜。8 000 g離心10 min，殘渣用0.5 mL 60%甲醇浸取2 h，離心后取上清液，合并2次上清液，40 ℃氮氣吹干至不含有機相，加入0.5 mL 10%石油醚萃取脫色3次，棄去上層醚相，下層40 ℃氮氣吹干，加入25%乙酸乙酯定容至0.5 mL，取適量溶液用針頭式過濾器過濾于帶有內襯管的樣品瓶內待測[8]。色譜檢測步驟及條件：開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，保留時間60 min，檢測波長254 nm，設置完畢保存方法組；用流動相過柱子，待基線穩(wěn)定后開始加樣。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 文中每個數(shù)據(jù)點來自3個重復的平均值，采用SPSS Statistic 25.0軟件進行t檢驗。通過數(shù)據(jù)分析檢測不同光強處理對胡椒葉片光合作用、激素含量和花穗數(shù)目的影響是否存在顯著差異。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 光強對胡椒源葉光合作用的影響

室內光強模擬試驗研究光強對胡椒源葉光合作用的影響。發(fā)現(xiàn)在花穗穩(wěn)定后測量葉片光合作用，發(fā)現(xiàn)270 μmol·m-2·s-1光強處理下，光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)都顯著高于405 μmol·m-2·s-1，分別比405 μmol·m-2·s-1處理增加了60%、100%和54%。田間原位遮蔭試驗研究發(fā)現(xiàn)，遮蔭處理處理下，胡椒源葉光合參數(shù)都高于全光照處理，但是均不顯著。室內和田間原位試驗都發(fā)現(xiàn)降低光強的處理反而會提升胡椒葉片光合作用(表1)。

表1 光強對胡椒源葉光合作用的影響

2.2 光強對胡椒源葉激素含量的影響

2.2.1 室內光強模擬對胡椒源葉激素含量影響 通過室內光強模擬試驗研究光強對胡椒穩(wěn)定葉片內源激素含量的影響，發(fā)現(xiàn)低光強270 μmol·m-2·s-1處理相對于光強高405 μmol·m-2·s-1處理，提升了源葉生長素(IAA)和脫落酸(ABA)含量，降低了赤霉素(GA3)含量，其中對GA3含量影響較大，但是差異都不顯著。而后又分析了源葉赤霉素與脫落酸相對含量(GA3/ABA)，發(fā)現(xiàn)低光強270 μmol·m-2·s-1處理相對于光強高405 μmol·m-2·s-1處理顯著降低了該比值20%；分析源葉生長素與脫落酸相對含量(IAA/ABA)，發(fā)現(xiàn)兩種光強處理對該比值沒有顯著影響(表2)。

2.2.2 田間原位遮蔭對胡椒源葉激素含量影響 通過田間原位遮蔭試驗，研究光強對胡椒花穗發(fā)育不同階段相應源葉激素含量的影響，發(fā)現(xiàn)光強改變可以調控源葉激素含量，低光照可以降低源葉IAA含量，其中，在花穗發(fā)育到8 cm時，源葉IAA含量顯著降低53%(圖1-A)；隨著花穗的增長，源葉GA3含量是不斷增加的，遮蔭處理相對于全光照處理增加較多，但是差異不顯著(圖1-B)，光強改變對花穗發(fā)育到2 mm和4 cm時相應葉片的ABA含量沒有顯著影響，遮蔭處理顯著降低了8 cm花穗相應葉片ABA含量13%(圖1-C)。隨著花穗從2 mm長至8 cm，源葉GA3/ABA的值是不斷增加的，遮蔭和全光照無顯著差異，在4 cm和8 cm階段稍高于全光照(圖1-D)?；ㄋ氚l(fā)育不同階段，遮蔭處理下源葉IAA/ABA的值都低于全光照處理，其中花穗長至8 cm時差異達顯著含量，遮蔭處理比全光照低56%(圖1-E)。

2.3 光強對胡椒花穗數(shù)目的影響

室內光強模擬試驗研究發(fā)現(xiàn)光強改變對胡椒抽穗數(shù)沒有顯著影響，但是會影響胡椒花穗脫落數(shù)，較低光強處理270 μmol·m-2·s-1相對于較高光強405 μmol·m-2·s-1處理顯著增加了花穗脫落數(shù)，最終導致成穗數(shù)目顯著降低了59%(圖2-A)；田間原位遮蔭試驗研究發(fā)現(xiàn)遮蔭會顯著降低胡椒抽穗數(shù)目，相對于全光照降低了40%，遮蔭增加了胡椒花穗脫落數(shù)，但是不顯著，最終胡椒成穗數(shù)目顯著降低36%(圖2-B)。

表2 室內光強模擬對胡椒源葉赤霉素含量的影響

注：柱狀圖上方“(+)”代表不同處理間差異顯著(P=0.05)，n.s.代表不同處理間無顯著差異。下同。

3 結論與討論

光強過高導致胡椒光合速率降低[9]，光強過低導致胡椒花量減少[10]，而且不適宜光強還會導致胡椒生理過程紊亂[11]，因此，探明胡椒對不適宜光強做出的適應性反應，對調控胡椒生理過程，進而增加胡椒花量、提高產量具有重要意義。本文采用研究不同光強對胡椒源葉光合作用和激素含量的影響，探明了響應光強脅迫、調控胡椒成穗的關鍵源葉光合作用參數(shù)和激素指標。

室內光強模擬試驗和田間原位遮蔭試驗的研究結果，都表明高光強會降低葉片光合作用能力，光合速率、氣孔導度和蒸騰速率在較高光強條件下降低，其中室內光強模擬試驗處理間差異顯著。這些參數(shù)中，氣孔導度降低最多，可能是胡椒響應光脅迫的關鍵光合作用參數(shù)。氣孔導度的改變可能是植物遇到脅迫時的一種反應，ABA信號途徑在植物脅迫應答中起核心作用[12]，增加植物體內ABA含量會導致葉片氣孔導度降低[13]。本研究測定了植物葉片內源ABA含量，發(fā)現(xiàn)田間遮蔭試驗，較高光強處理下胡椒花穗發(fā)育至8 cm時，相應穩(wěn)定葉片ABA含量相對于低光強處理顯著增加，可能與田間原位試驗有高光強脅迫相關。田間全光照處理光合有效輻射值在中午較大，最終可以達到1 110 μmol·m-2·s-1，超過了胡椒的光飽和范圍450 ～900 μmol·m-2·s-1[1]，導致胡椒通過增加源葉ABA含量應答高光強脅迫，ABA與受體結合，抑制PP2C磷酸酶活性[14]，進而使SnRK2s 從PP2C-SnRK2的復合物中釋放出來，激活的SnRK2s 能夠磷酸化并激活下游的ABF等轉錄因子，這些轉錄因子能夠調控下游的ABA應答基因，從而激活ABA信號[15-17]，降低氣孔導度。田間原位試驗發(fā)現(xiàn)的光強增加導致葉片氣孔導度降低、ABA含量增加，這種抗逆反應可能是促使胡椒成穗增加的關鍵因素之一。從田間試驗光強對花穗數(shù)目的調控來看，光強調控的主要是花穗的抽生數(shù)目，但是，田間原位試驗中，全光照處理下，胡椒2 mm花穗對應葉片中ABA沒有顯著增加，一方面可能是ABA向庫器官轉運了，另一方面可能是GA3的拮抗作用導致的[12]。

圖2 光強對胡椒花穗數(shù)目的影響

光強和激素信號途徑存在交叉互作影響[18-19]，GA3是光合作用的調節(jié)劑[3]，IAA對光合作用有促進作用，所以本文又研究了內源IAA和GA3對光強的響應。室內光強模擬試驗研究發(fā)現(xiàn)不同光強對源葉IAA和GA3含量沒有顯著影響，田間原位試驗研究發(fā)現(xiàn)花穗發(fā)育不同階段全光照處理源葉IAA含量要高于遮蔭處理，其中8 cm花穗對應葉片IAA含量差異達顯著含量，葉片GA3含量，隨著花穗發(fā)育，2種光強處理下源葉GA3含量都是不斷增加的，其中遮蔭處理增加較多，但是與全光照無顯著差異。那么，室內光強模擬試驗2種光強處理下抽穗數(shù)無顯著差異，但是，較低光強處理會導致花穗脫落顯著增加，最終成穗數(shù)較低光強顯著小于較高光強；田間原位試驗2種光強處理下抽穗數(shù)達顯著含量，脫落數(shù)無顯著差異，較低光強抽穗數(shù)減少是導致成穗減少的關鍵。源葉激素含量在花穗抽生和脫落中起到一定作用，本研究發(fā)現(xiàn)室內光強模擬試驗，較低光強處理顯著降低了成熟源葉的GA3/ABA，這可能是導致其花穗脫落的關鍵因子，因為GA3含量的提升有利于胡椒花穗數(shù)目增加[6]，這與擬南芥的研究結果相似[20]，但是與郁金香[7]、芒果[21]和百合[22]研究結果不同，這可能是因為胡椒為短日照植物，在短日照植物中，因為缺乏光周期開花途徑的調控，赤霉素途徑扮演了重要的角色，成為了必須的調控途徑[23]。田間原位試驗發(fā)現(xiàn)，遮蔭會減少胡椒抽穗數(shù)目，從本研究結果看，這與激素含量相關性較小，盡管遮蔭降低了IAA/ABA，但是降低效果不顯著；遮蔭沒有增加胡椒花穗脫落數(shù)，推測是因為遮蔭條件下胡椒GA3/ABA沒有顯著降低，所以，適度提高GA3/ABA比值是保證花穗不脫落的關鍵因素。

綜上所述，光強改變可以通過影響胡椒光合作用和激素含量調控胡椒花穗數(shù)目。本研究發(fā)現(xiàn)光強調控激素含量影響胡椒成穗的原因有2方面：首先，在光強不適宜條件下，如果光強可以誘導胡椒葉片ABA含量增加、氣孔導度降低，就可能會導致成穗數(shù)目增加；其次，在光強不適宜條件下，GA3/ABA比值過低就會導致胡椒花穗脫落。所以，生產中應確保穩(wěn)定葉片中GA3/ABA比值在1.5～2.0范圍內，在主花期選擇適宜的光強或噴施GA3和ABA等生物刺激素，可以提升葉片光合作用，增加成穗數(shù)目；非主花期采用遮蔭或噴施刺激素的技術手段降低葉片GA3/ABA比值，使花穗脫落，可以減少樹體養(yǎng)分損失，節(jié)約人工摘花成本。