郝愛平， 薛巨坤， 吳啟康， 任如意， 魏繼承， 國會艷

(牡丹江師范學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157011)

早在20世紀80年代就有科研工作者研究植物毛狀根的應(yīng)用，但到目前為止研究最多的還是藥用植物，藥用植物毛狀根分泌的次生代謝產(chǎn)物可作為治療某些疾病藥物的有效成分之一。如單萜吲哚生物堿文多靈和長春堿僅在藥用植物長春花﹝Catharanthusroseus(L.)G. Don〕中合成，是醫(yī)學(xué)上生產(chǎn)抗癌藥物長春花堿和長春新堿的2種重要前體。SUN等[1]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使長春花毛狀根中含有文多靈，還在毛狀根中檢測出2種新的代謝物環(huán)氧T16H和洛可辛堿。QI等[2]在丹參毛狀根中用含有0.5%的Triton X-100的蛋白提取緩沖液成功分離出相對較多的CYP76AH1蛋白，為深入分析丹參酮代謝途徑提供了依據(jù)。研究表明，毛狀根誘導(dǎo)技術(shù)還可以有效提高番茄(Solanumlycopersicum)中番茄紅素的含量[3]。齊墩果酸是治療肝病的輔助藥的有效成分之一[4]。而萬壽菊(TageteserectaL)經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌15834菌株處理后可以獲得毛狀根，毛狀根經(jīng)茉莉酸處理后其合成齊墩果酸的能力增加了10倍。ALI等[5-7]研究表明，植物毛狀根在大規(guī)模積累次級代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)代謝途徑和抗菌藥的研究開發(fā)等方面具有重要意義。

瞿麥(DianthussuperbusL.)又名野麥、石桂花等，系常用中藥，為石竹科植物瞿麥的帶花地上部分，主產(chǎn)于河北、河南、遼寧等地[8]。瞿麥除具有觀賞價值外，還含有5-羥基-7，3′，4′-三甲氧基二氫黃酮、5，3′-二羥基-7，4′-二甲氧基二氫黃酮、Β-菠甾醇、胖大海A等成分[9]，因此瞿麥在臨床上對治療糖尿病性水腫、慢性前列腺炎、各種出血及腹瀉等疾病有獨特效果[10]。瞿麥還含有大黃素、積雪草酸等多種活性成分，對乳腺癌、腎癌等細胞具有顯著抑制作用[11-14]。由于藥用植物本身的次生代謝產(chǎn)物存在產(chǎn)量低和不穩(wěn)定等特點，而毛狀根培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短，次生代謝成分合成能力強，能合成新化合物等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于藥用植物應(yīng)用研究[15]。目前，鮮見關(guān)于瞿麥的毛狀根研究的報道。為此，選用2種常用的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株和R1601菌株侵染藥用植物瞿麥的葉片，探究影響毛狀根誘導(dǎo)的因素，優(yōu)化誘導(dǎo)毛狀根培養(yǎng)條件，提高瞿麥毛狀根的誘導(dǎo)率，以期為瞿麥毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)，并為大規(guī)模開發(fā)利用瞿麥次級代謝產(chǎn)物提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

瞿麥種子，購于河北省安國中藥材推廣站，瞿麥為經(jīng)種子萌發(fā)的無菌苗，實驗室培養(yǎng)。

發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株和R1601菌株，均保存于牡丹江師范學(xué)院分子實驗室。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 將保存的菌株從-80℃冰箱取出，融化預(yù)先滅菌的LB(100 mL)固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻至55℃左右時在超凈工作臺內(nèi)加入卡那霉素(50 mg/mL)100 μL，輕輕搖動培養(yǎng)基使卡那霉素混合均勻，然后倒平板。待平板冷卻凝固時，用接種環(huán)蘸取少量菌液，之字形平板劃線接種于培養(yǎng)基上，并用封口膜封好。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗倒置培養(yǎng)48 h使其活化。在超凈工作臺內(nèi)，用移液槍加入卡那霉素于無菌的三角瓶內(nèi)，用提前滅菌的牙簽尖端挑取培養(yǎng)48 h左右的單菌落，并將牙簽置于含有LB液體培養(yǎng)基三角瓶內(nèi)，隨后將三角瓶用封口膜封好放置在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為28℃，180 r/min培養(yǎng)至菌液濃度A600OD值為0.4～0.6時將三角瓶從搖床中取出備用。

1.2.2 瞿麥葉片預(yù)培養(yǎng) 將瞿麥無菌苗從MS固體培養(yǎng)基中用無菌的鑷子輕輕取出，放置在無菌的培養(yǎng)皿中，用刀片將無菌苗的根部和葉柄切除，把葉片放置在加入1/2MS固體培養(yǎng)基中，25～26℃光照預(yù)培養(yǎng)2 d。

1.2.3 侵染與共培養(yǎng) 分別將A4及R1601菌液倒入50 mL離心管中，5 000 r/min，離心10 min。離心后的菌液在超凈工作臺內(nèi)倒出上清液，加入等體積的1/2MS液體培養(yǎng)基，振蕩離心管使菌體懸浮。然后每個無菌的三角瓶內(nèi)加入100 μL的乙酰丁香酮(AS)，再將菌液倒入三角瓶內(nèi)，封口膜封好，把三角瓶放進振蕩培養(yǎng)箱，28℃，180 r/min，震蕩培養(yǎng)30 min。把預(yù)培養(yǎng)的葉片用無菌的手術(shù)刀把葉片的尖端和基部各切1個傷口，再把帶傷口的葉片放進菌液中，放置振蕩培養(yǎng)箱中，28℃，180 r/min，分別震蕩侵染3 min、5 min、10 min和15 min。隨后將葉片從菌液中用鑷子夾出來，在無菌的吸水紙上吸去多余的菌液，以防菌液濃度過大、長勢過盛，使得葉片致死。再將葉片轉(zhuǎn)接到加入了AS的1/2MS固體培養(yǎng)基上，放在恒溫培養(yǎng)箱中23℃，黑暗倒置共培養(yǎng)2 d。觀察記錄不同侵染時間下的外植體數(shù)量、毛狀根平均數(shù)，計算誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率=長出毛狀根外植體/侵染外植體總數(shù)×100%

1.2.4 除菌和繼代培養(yǎng) 用無菌的鑷子將暗培養(yǎng)后的外植體在無菌的吸水紙上吸去多余水分放入含有頭孢的1/2MS固體培養(yǎng)基。為了抑制發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株和R1601菌株的過度生長，前3次除菌時每隔2 d除菌1次，此時頭孢的濃度為500 mg/L。當(dāng)后期發(fā)根農(nóng)桿菌比較少時每隔5 d除菌1次，為了避免因除菌培養(yǎng)基內(nèi)頭孢含量過高致使瞿麥葉片變黃，再把頭孢的濃度調(diào)為400 mg/L。當(dāng)毛狀根生長至3～5 cm時，用無菌的手術(shù)刀在超凈工作臺內(nèi)從毛狀根基部將毛狀根切除，再用鑷子把毛狀根輕輕轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，每5 d需要繼代1次。繼代培養(yǎng)基分別為1/2MS固體培養(yǎng)基、1/2MS液體培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接到1/2MS液體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基時，放置在振蕩培養(yǎng)箱25℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接在1/2MS固體培養(yǎng)基和MS固體培養(yǎng)基時則需要25℃光照培養(yǎng)。觀察瞿麥毛狀根在不同類型培養(yǎng)基的擴繁情況。

1.2.5 毛狀根的分子鑒定 采取常規(guī)CTAB法分別提取未侵染瞿麥組培苗和瞿麥毛狀根基因組DNA。以瞿麥毛狀根DNA為模板，菌株A4及R1601作為陽性對照，瞿麥未經(jīng)侵染的外植體DNA作為陰性對照進行PCR擴增。反應(yīng)體系為10 μL混合酶試劑[Premix TAP(Takapa TAP Version 2.0 plus dye)、2 μL rolB引物、7 μL水和模板1 μL]。反應(yīng)程序：95℃5 min預(yù)變性，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，進行30個循環(huán)后72℃保溫5 min。PCR擴增結(jié)束后，將其擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 A4和R1601菌株不同侵染時間對瞿麥毛狀根誘導(dǎo)率的影響

由表1和圖1A～D可知，A4菌株分別侵染瞿麥葉片3 min、5 min、10 min和15 min后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)出毛狀根，說明A4菌株適于誘導(dǎo)瞿麥毛狀根。瞿麥侵染3 min、5 min、10 min和15 min的毛狀根誘導(dǎo)率分別為52.90%、81.2%、73.3%和56.2%，說明侵染時間超過5 min后，毛狀根的誘導(dǎo)率隨侵染時間的延長而下降，故A4菌株侵染瞿麥葉片5 min時誘導(dǎo)率最高，毛狀根分支較多，長勢良好。

由表1和圖1E～H可知，R1601菌株分別侵染瞿麥葉片3 min、5 min、10 min和15 min后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)出毛狀根，說明R1601菌株適于誘導(dǎo)瞿麥毛狀根。但不同侵染時間的誘導(dǎo)率有所差別，當(dāng)侵染時間為10 min時，其毛狀根的誘導(dǎo)率最高，為78.60%。侵染時間為0～10 min隨著侵染時間的延長，毛狀根的誘導(dǎo)率隨之增高，當(dāng)侵染時間大于10 min，毛狀根的誘導(dǎo)率降低且葉片褐化嚴重直至最后干枯死亡，故R1601菌株最佳侵染時間為10 min，此時誘導(dǎo)率最高毛狀根長勢較好。

表1 A4和R1601菌株不同侵染時間的瞿麥毛狀根誘導(dǎo)率

2.2 不同培養(yǎng)基類型對瞿麥毛狀根增殖的影響

由圖2可知，1/2MS固體培養(yǎng)基上瞿麥毛狀根的每根毛狀根上面都新生長出了很多乳白色絨毛狀的側(cè)根，而MS固體培養(yǎng)基上的毛狀根只有3根毛狀根新長出了側(cè)根，且側(cè)根的數(shù)量比1/2MS固體培養(yǎng)基少。所以瞿麥毛狀根在1/2MS固體培養(yǎng)基中比MS固體培養(yǎng)基長勢更好。由于1/2MS培養(yǎng)基大量元素減少了50%，由此推測瞿麥毛狀根在低鹽培養(yǎng)基中長勢更好。

此外，瞿麥毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后的重量明顯增加，新長出的毛狀根較纖細并呈現(xiàn)出抱團現(xiàn)象。然而，毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基的長勢比MS液體培養(yǎng)基好。對比毛狀根在1/2MS固體培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基、1/2MS液體培養(yǎng)基、MS液體培養(yǎng)基生長狀況發(fā)現(xiàn)，毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基中的生長狀況優(yōu)于固體培養(yǎng)基。

由圖3可知，瞿麥毛狀根質(zhì)量在1/2MS液體培養(yǎng)基中前4次繼代時呈上升趨勢，在第5次繼代時質(zhì)量有所下降。毛狀根在第1天放入1/2MS液體培養(yǎng)基中增殖時質(zhì)量為0.336 g，當(dāng)培養(yǎng)至第16天時質(zhì)量為2.915 g，僅15 d毛狀根質(zhì)量約增加7.7倍，說明瞿麥毛狀根適于在1/2MS液體培養(yǎng)基中擴繁。在第5次繼代時毛狀根的質(zhì)量下降可能是由于毛狀根的老化造成。

2.3 瞿麥毛狀根的分子鑒定

由圖4可知，2～5號點樣孔上方在425 bp左右出現(xiàn)明顯條帶。其中1號點樣孔沒有條帶，4～5號點樣孔上方出現(xiàn)的條帶與2號、3號點樣孔陽性對照結(jié)果一致，表明農(nóng)桿菌A4及R1601的Ri質(zhì)粒中的T-DNA所含有的rolB基因已經(jīng)成功整合到瞿麥的基因組中，說明試驗所得毛狀根是經(jīng)過A4及R1601侵染誘導(dǎo)后得到的。

3 結(jié)論與討論

瞿麥葉片經(jīng)A4菌株和R1601菌株侵染后均能誘導(dǎo)出毛狀根，侵染時間不同，誘導(dǎo)率也不相同，用A4菌株侵染5 min時誘導(dǎo)率最高，為81.2%；用R1601菌株侵染10 min時誘導(dǎo)率最高，為78.60%。瞿麥毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基中擴繁效果最好。

另外，在誘導(dǎo)藥用植物瞿麥毛狀根時發(fā)現(xiàn)，毛狀根的誘導(dǎo)率與瞿麥葉片的年齡和外植體的大小有很大關(guān)系。當(dāng)瞿麥葉片年齡和外植體的大小都較小時，隨著培養(yǎng)時間的增長，外植體褐化程度也會越來越嚴重，直至最后死亡。當(dāng)選用的瞿麥葉片年齡較大且外植體較大時，外植體在培養(yǎng)過程中只有輕微的失綠現(xiàn)象，且誘導(dǎo)出的毛狀根長較粗壯。由于瞿麥毛狀根比較纖細且毛狀根有時會伸進培養(yǎng)基，在除菌2次左右時，外植體會變得比較脆，所以在除菌時應(yīng)該用鑷子小心夾取長出毛狀根的外植體，避免破壞毛狀根和外植體。

影響毛狀根誘導(dǎo)效果的因素多種多樣，如菌種類型、培養(yǎng)基類型、菌液OD值、侵染時間、侵染方式等。同一植物材料用不同的菌種侵染時，效果也不盡相同，每種植物外植體都有誘導(dǎo)率相對較高的菌種。如薛雯心等[16]用A4、C58C1和A14763菌株誘導(dǎo)黨參毛狀根發(fā)現(xiàn)，A4誘導(dǎo)率最高。然而，任如意等[17]用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1、R1601和ATCC15834菌株侵染毛酸漿外植體發(fā)現(xiàn)，4種發(fā)根農(nóng)桿菌均能誘導(dǎo)毛酸漿外植體產(chǎn)生毛狀根，其中ATCC15834的誘導(dǎo)率相對較高。培養(yǎng)基的類型不同，所含的成分也千差萬別，不同的培養(yǎng)基類型為毛狀根生長提供不同的營養(yǎng)物質(zhì)，因此選擇合適的培養(yǎng)基會更利于毛狀根的生長。鄒凱等[18]以發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060誘導(dǎo)甜葉菊毛狀根，建立毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類物質(zhì)體系，結(jié)果表明，MS液體培養(yǎng)基較B5和WPM更利于甜葉菊毛狀根生長及綠原酸類物質(zhì)的積累。施和平等[19]用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 15834誘導(dǎo)美洲商陸毛狀根時發(fā)現(xiàn)，在供試的MS、1/2MS、B5和6，7-V液體培養(yǎng)基中，以無外源激素的MS液體培養(yǎng)基最適合美洲商陸毛狀根根系生長。針對外植體的生長狀況選擇合適的侵染時間是影響毛狀根誘導(dǎo)率的一個關(guān)鍵因素之一。李素紅等[20]在誘導(dǎo)決明毛狀根的研究中發(fā)現(xiàn)，浸染時間在5 s至20 min隨著浸染時間的延長，外植體的誘導(dǎo)率變化不顯著，但平均每個誘導(dǎo)外植體的毛狀根干重卻在逐漸下降，浸染30 min，誘導(dǎo)率顯著降低，平均每個誘導(dǎo)外植體的毛狀根干重也顯著降低。故決明毛狀根培養(yǎng)的最佳浸染時間是5s，即浸濕后立刻取出。陳晨[21]對蠶豆外植體分別侵染5 min、10 min和15 min發(fā)現(xiàn)，侵染5 min與侵染10 min、15 min誘導(dǎo)率相差較大，而侵染10 min與15 min誘導(dǎo)率相差不大。劉連旺等[22]誘導(dǎo)地黃毛狀根發(fā)現(xiàn)，侵染10 min時地黃毛狀根的誘導(dǎo)效果最佳，之后隨著侵染時間的增加，誘導(dǎo)率逐漸下降。對大多數(shù)的植物材料來說，一般最合適的侵染時間為8～15 min，一旦超過了最適侵染時間，隨著侵染時間的延長，毛狀根的誘導(dǎo)率反而會降低。A600的OD值對毛狀根的誘導(dǎo)率也有極其重要的影響，宗曉秋[23]在誘導(dǎo)大豆毛狀根的過程中發(fā)現(xiàn)，菌液A600OD為0.6時，毛狀根的轉(zhuǎn)化率最高，A600OD值為0～0.6時，毛狀根的轉(zhuǎn)化率與菌液A600OD值呈正相關(guān)，A600OD值為0.6～1.5時，二者呈負相關(guān)。林志豪等[24]在誘導(dǎo)黃瓜毛狀根時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD600值小于0.8時，毛狀根誘導(dǎo)率較低，為21.24%～57.69%；OD600值為1.2時，黃瓜毛狀根誘導(dǎo)率大大提高，為70.83%。

綜上所述，影響植物毛狀根誘導(dǎo)的條件多種多樣，相關(guān)科研工作者需通過不斷探究找到不同材料誘導(dǎo)毛狀根生長的最優(yōu)條件。研究初步建立了瞿麥毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)技術(shù)，后續(xù)還需對瞿麥毛狀根的有效成分進一步研究。