滕 林 曹春雨 周 飛 楊 偉 李 松 丁家望

(1.三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 心血管內(nèi)科 & 三峽大學(xué) 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌 443002)

臨床上右冠狀動(dòng)脈閉塞時(shí)，往往導(dǎo)致竇房結(jié)動(dòng)脈灌注不足，影響竇房結(jié)功能，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重心動(dòng)過(guò)緩、竇性停搏及高度房室傳導(dǎo)阻滯等緩慢型心律失常的發(fā)生。右冠狀動(dòng)脈閉塞所致心律失常是急性缺血性心肌病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致心臟驟停甚至死亡的主要原因之一[1，2]。右冠狀動(dòng)脈閉塞所致竇房結(jié)灌注不足可引起一系列竇房結(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與電生理功能改變，且其確切的分子機(jī)制尚未闡明[3-5]。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控非選擇性陽(yáng)離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN channel) 在調(diào)控細(xì)胞的起搏電流及維持其電生理功能方面有著極其重要的作用，竇房結(jié)組織中的HCN異常表達(dá)可導(dǎo)致竇房結(jié)功能失調(diào)和心律失常等一系列心臟功能狀態(tài)改變，而且這種異常表達(dá)可能是竇房結(jié)動(dòng)脈灌注不足誘發(fā)心律失常發(fā)生的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)[6，7]。前期在離體竇房結(jié)細(xì)胞缺血再灌注模型中，我們研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道家族中HCN4 高表達(dá)于心臟竇房結(jié)細(xì)胞，并參與竇房結(jié)細(xì)胞起搏功能的調(diào)控過(guò)程。急性心肌缺血時(shí)竇房結(jié)細(xì)胞凋亡增多，HCN4表達(dá)下調(diào)，竇房結(jié)功能被抑制。而早期再灌注治療可明顯增加HCN4的表達(dá)，使得If通道電流密度增多而促進(jìn)竇房結(jié)功能恢復(fù)[8，9]。由于HCN4高表達(dá)于竇房結(jié)組織，同時(shí)其具有作為起搏基因的相關(guān)電生理特性，又因竇房結(jié)動(dòng)脈主要起源于右冠狀動(dòng)脈的解剖特點(diǎn)[10，11]，我們推斷HCN4表達(dá)異常可能是臨床上急性右冠缺血/再灌注事件后緩慢型心律失常發(fā)生的主要原因。因此，本研究在細(xì)胞研究基礎(chǔ)上，以右冠狀動(dòng)脈結(jié)扎、再灌的新西蘭大耳白兔為竇房結(jié)缺血再灌注模型，通過(guò)同步記錄體表心電圖及心腔內(nèi)電圖試圖闡明HCN4在竇房結(jié)組織中的表達(dá)水平與缺血及缺血再灌注時(shí)竇房結(jié)電生理功能損傷及修復(fù)之間的關(guān)系，從整體水平探索竇房結(jié)急性缺血后緩慢型心律失常發(fā)生的分子機(jī)制，為心肌缺血后惡性心律失常的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

HCN4抗體(Santa Cruz公司)、羊抗兔β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記二抗IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Total DNA/RNA Protein Kit(OMEGA公司)；ECL發(fā)光液(武漢博士德生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒(上海天根生物有限公司)；PCR試劑盒及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Takara公司)；四道生理記錄儀(RM-6200，成都儀器廠)、心電圖機(jī)(ECG-6511 型，日本)、示波器(LMS-2A，日本) 、小動(dòng)物呼吸機(jī)(HD-40，浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年新西蘭大白兔70只，雌雄不拘，體重2.5～3.5 kg，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，符合國(guó)家醫(yī)用動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，20℃～25℃條件下飼養(yǎng)2周后實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁飲4 h, 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用方案經(jīng)過(guò)三峽大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.3 兔缺血再灌注模型的建立與分組

按隨機(jī)數(shù)字表法將新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血30 min、60 min、120 min 組及缺血120 min再灌注60 min、120 min、240 min組，每組10 只。對(duì)照組僅開(kāi)胸不結(jié)扎右冠狀動(dòng)脈。手術(shù)組用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈麻醉后，切開(kāi)頸部，分離出氣管，倒“T”形切口插入氣管插管行人工正壓通氣；然后分離、結(jié)扎及切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)、雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)及結(jié)扎所有的分支，以消除自主神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)竇房結(jié)電生理功能的影響；而后沿胸正中線稍偏右切開(kāi)皮膚、皮下組織及肌肉，切斷 2～5 肋暴露心臟，從主動(dòng)脈根部分離出右冠狀動(dòng)脈，在右冠狀動(dòng)脈分出第一分支前的起始部下方套帶一細(xì)橡膠管的結(jié)扎線，通過(guò)橡膠管鉗夾或放松兩端結(jié)扎線以造成竇房結(jié)動(dòng)脈急性閉塞或再灌注。

由頸動(dòng)脈插入自制的希氏束電極至主動(dòng)脈根部記錄希氏束電圖(濾波：1 kHz；靈敏度：1 mv/cm)，同時(shí)用針形電極刺入兔四肢皮下記錄體表心電圖，將以上信號(hào)輸入四導(dǎo)電生理記錄儀并顯示于示波器的熒光屏上，于各觀察時(shí)相點(diǎn)同步記錄希氏束電圖及體表Ⅱ?qū)?lián)心電圖(走紙速度25 mm/s)。數(shù)據(jù)記錄完畢后，剪開(kāi)上腔靜脈和下腔靜脈，于上腔靜脈入口以下至腔耳角向外下沿界嵴到下腔靜脈口這一區(qū)域切取竇房結(jié)組織，預(yù)冷的生理鹽水沖洗竇房結(jié)組織，于液氮凍存并用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

提取竇房結(jié)組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，與根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)的引物、探針等混合后在PCR儀上反應(yīng)并檢測(cè)，引物系列如下：HCN4-F1：5′-GTACTC CTACGCGCTCTTCA-3′，R1：5′-GCTCTCCTCGTC GAACATCT-3′，313 bp；β-actin-F1：5′-CGGGAAA TCGTGCGTGAC-3′，R1：5′-TGGAAGGTGGACA GCGAGG-3′，266 bp。

1.5 Western blot檢測(cè)

提取竇房結(jié)組織蛋白，定量后以SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)印至雜交膜上。5%脫脂牛奶或3%BSA封閉非特異抗原后，一抗孵育過(guò)夜，TBST洗去非特異性結(jié)合一抗，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，然后以TBST洗去非特異性結(jié)合二抗，加入ECL顯影液室溫孵育2 min，分析目標(biāo)蛋白條帶。

1.6 心電圖及心內(nèi)電生理檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組分別于結(jié)扎右冠狀動(dòng)脈前、結(jié)扎右冠狀動(dòng)脈后30 min、60 min、120 min，缺血120 min再灌注后60 min、120 min、240 min同步記錄體表心電圖、心腔內(nèi)電圖。測(cè)量各組不同時(shí)相點(diǎn)AA 間期( p-p 間期)、AH 間期及HV 間期，記錄心律失常的發(fā)生情況。若AA 間期較結(jié)扎右冠狀動(dòng)脈前延長(zhǎng)>40 ms, 被視為AA 間期延長(zhǎng)。以AH 間期延長(zhǎng)≥20 ms 作為房室傳導(dǎo)阻滯診斷標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱ、Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯及其它心律失常以人類(lèi)心律失常診斷標(biāo)準(zhǔn)判定[12]。對(duì)照組觀察指標(biāo)同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血及缺血再灌注兔體表心電圖變化及心律失常的評(píng)估

對(duì)照組10 只兔子均存活，無(wú)心律失常發(fā)生；缺血組不同時(shí)間點(diǎn)60只兔子(含缺血120 min再灌注組后30只)在缺血期共有49只發(fā)生竇性停搏、房室傳導(dǎo)阻滯、竇性心動(dòng)過(guò)緩伴不齊的緩慢型心律失常(81.67%)。其中缺血30 min組無(wú)死亡，心電圖提示心率減慢，Ⅱ?qū)?lián)ST段較對(duì)照組明顯抬高，P-R間期明顯延長(zhǎng)，發(fā)生不同程度房室傳導(dǎo)阻滯；隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Ⅱ?qū)?lián)逐漸形成病理性Q波，T波逐漸倒置。缺血組不同時(shí)間點(diǎn)共有11只因發(fā)生心室顫動(dòng)、室性心動(dòng)過(guò)速及心房顫動(dòng)等其他心律失常而死亡；其中缺血60 min后死亡2只，缺血120 min后(含缺血120 min再灌注后30只)共死亡9只，余存活大鼠均發(fā)生不同程度的心動(dòng)過(guò)緩、竇性停搏及高度房室傳導(dǎo)阻滯等緩慢型心律失常。缺血120 min后存活兔經(jīng)再灌注后均無(wú)死亡；再灌注早期(1～5 min)出現(xiàn)不同類(lèi)型的再灌注心律失常，以交界區(qū)緩慢型心律失常為主；隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，心率逐漸恢復(fù)正常，ST段回落，病理性Q波明顯加深，P-R間期恢復(fù)正常，逐漸恢復(fù)竇性心律。

2.2 缺血及缺血再灌注對(duì)兔竇房結(jié)組織HCN4表達(dá)的影響

PCR及Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，急性缺血可誘導(dǎo)竇房結(jié)組織中HCN4 mRNA及蛋白水明顯下降，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，HCN4進(jìn)一步下降(均P<0.05)；再灌注60 min后，HCN4 mRNA及蛋白水平較缺血組升高，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，HCN4 mRNA及蛋白水平明顯上升(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 對(duì)照組AA、AH、HV 間期的變化

對(duì)照組均未發(fā)生心律失常，心內(nèi)電圖未記錄到竇性心動(dòng)過(guò)緩、竇性停搏、竇房阻滯、房室傳導(dǎo)阻滯等緩慢型心律失常的發(fā)生；AA 間期與開(kāi)胸前相比，變化未超過(guò)40 ms。表明開(kāi)胸后不結(jié)扎右冠狀動(dòng)脈，AA 間期、AH間期及HV間期與開(kāi)胸前比較均無(wú)顯著差異(均P>0. 05) ，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組開(kāi)胸前后AA、AH及AV間期的變化

2.4 缺血組AA、AH、HV間期的變化

心內(nèi)電生理檢查結(jié)果顯示，與結(jié)扎右冠狀動(dòng)脈前比，結(jié)扎后30 min、60 min、120 min的AA、AH間期均有不同程度的延長(zhǎng)，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)AA、AH也逐漸延長(zhǎng)(均P<0.05)，HV間期與結(jié)扎前未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 缺血前、后AA、AH及AV間期的變化

2.5 缺血再灌注組AA、AH、HV間期的變化

右冠狀動(dòng)脈再灌注后，均出現(xiàn)一過(guò)性的再灌注心律失常，以交界區(qū)緩慢型心律失常為主，于再灌注后5 min 內(nèi)逐漸恢復(fù)正常。心內(nèi)電生理檢查結(jié)果顯示，與再灌注前比，再灌注后60 min、120 min、240 min的 AA 、AH間期均有不同程度的縮短(均P<0.05)，而再灌注后各組HV間期未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 缺血再灌注前、后AA、AH及HV間期的變化

3 討論

心臟起搏沖動(dòng)起源于上腔靜脈與右心耳心內(nèi)膜下的竇房結(jié)組織，這些沖動(dòng)由特殊分化的心肌細(xì)胞形成，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生維持竇性心律的動(dòng)作電位[13]。竇房結(jié)血供主要由竇房結(jié)動(dòng)脈支配，多數(shù)起源于右冠狀動(dòng)脈。因此，右冠狀動(dòng)脈急性閉塞將導(dǎo)致竇房結(jié)血流灌注不足，影響竇房結(jié)細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致竇房結(jié)電生理功能的異常。正常的起搏電流參與竇房結(jié)自主節(jié)律的產(chǎn)生和控制，與心臟節(jié)律的維持密切相關(guān)，而竇房結(jié)電生理功能的異常又與其編碼起搏電流離子通道家族的基因有明顯關(guān)系[14]。

在心血管系統(tǒng)中， HCN通道高表達(dá)于心臟起搏細(xì)胞中，在參與心臟自主搏動(dòng)和對(duì)節(jié)律的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[15]。HCN通道是四聚體，類(lèi)似于電壓門(mén)控鉀通道和環(huán)核苷酸調(diào)控的鉀通道。已知有4種不同的亞型(HCN 1～4)，它們?cè)谛呐K中都有不同程度的表達(dá)。尤其是HCN4亞型在竇房結(jié)表達(dá)最多，其次是HCN1和HCN2[16]。在人心臟中，HCN4是迄今為止發(fā)現(xiàn)在心臟竇房結(jié)、房室結(jié)、普肯耶纖維傳導(dǎo)系統(tǒng)中表達(dá)量最高的HCN通道亞型，而周?chē)姆拷M織中卻無(wú)表達(dá)[17]。HCN4在竇房結(jié)細(xì)胞舒張期去極化過(guò)程中起到重要作用，由于其形成的離子通道具有生理性起搏電流(If)的特征，與心臟起搏的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)關(guān)系密切，因此HCN4又被稱(chēng)為起搏基因[18]。HCN4的表達(dá)改變與多種心臟疾病、心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。Stieber等[19]研究發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)急性缺血再灌注損傷后產(chǎn)生某些心律失常的原因可能是竇房結(jié)組織HCN4表達(dá)降低，使得其主導(dǎo)的起搏電流異常所致。Zicha等[20]研究表明，竇房結(jié)組織HCN4的表達(dá)下調(diào)參與了充血性心衰所誘導(dǎo)的竇房結(jié)電生理功能障礙。

急性冠脈綜合征時(shí)竇房結(jié)電生理功能的異常與心肌缺血及缺血再灌注損傷的輕重、缺血時(shí)間長(zhǎng)短密切相關(guān)。竇房結(jié)細(xì)胞作為一種特殊分化的心肌細(xì)胞，而HCN4作為起搏基因，極可能與心肌缺血時(shí)竇房結(jié)電生理功能的異常密切相關(guān)。在前期的研究中，我們通過(guò)建立竇房結(jié)細(xì)胞缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，HCN4可能參與調(diào)控急性缺血缺氧時(shí)竇房結(jié)細(xì)胞的起搏功能，HCN4表達(dá)下降抑制竇房結(jié)細(xì)胞的電生理功能，而早期再灌注治療可明顯增加HCN4的表達(dá)，使得通道If電流密度增多而使竇房結(jié)功能恢復(fù)[8，9]。由于細(xì)胞離體模型的影響因素頗多，因此本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討HCN4介導(dǎo)急性右冠狀動(dòng)脈閉塞時(shí)竇房結(jié)電生理功能障礙的機(jī)制。

本研究在兔右冠狀動(dòng)脈急性閉塞與再灌注模型的基礎(chǔ)上，觀察了缺血及再灌注不同時(shí)間點(diǎn)竇房結(jié)組織HCN4 mRNA及蛋白表達(dá)水平，并探討了其表達(dá)量變化與竇房結(jié)細(xì)胞電生理功能障礙的內(nèi)在聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血時(shí)HCN4在竇房結(jié)組織中表達(dá)水平明顯下降，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步降低；而早期再灌注后可明顯增強(qiáng)HCN4在竇房結(jié)組織中的表達(dá)。研究結(jié)果提示，起搏基因HCN4可能參與了急性心肌缺血時(shí)竇房結(jié)電生理功能障礙，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。

我們進(jìn)一步觀察缺血及缺血再灌注兔體表心電圖、心內(nèi)電圖的變化，對(duì)缺血、缺血再灌注時(shí)心律失常進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)一步明確HCN4與竇房結(jié)功能障礙的關(guān)系。研究結(jié)果表明，急性右冠狀動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)竇房結(jié)缺血時(shí)發(fā)生竇性停搏、房室傳導(dǎo)阻滯、嚴(yán)重竇性心動(dòng)過(guò)緩等緩慢型心律失常發(fā)生率較高，只有少數(shù)發(fā)生嚴(yán)重的心室顫動(dòng)、室性心動(dòng)過(guò)速及心房顫動(dòng)等其他心律失常，而這些心律失常的發(fā)生可能與竇房結(jié)細(xì)胞急性缺血后自律性降低及鄰近區(qū)域心房肌細(xì)胞缺血后心電不穩(wěn)定性增加有關(guān)[21]。及時(shí)再灌注可明顯減少緩慢型心律失常的發(fā)生，促進(jìn)竇性心律的恢復(fù)。通過(guò)心內(nèi)電生理進(jìn)一步明確記錄了缺血及缺血再灌注時(shí)AA、AH、HV 間期的變化。我們發(fā)現(xiàn)，急性竇房結(jié)缺血時(shí)AA、AH間期均有不同程度的延長(zhǎng)，與缺血時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)，而HV間期未見(jiàn)明顯變化。再灌注后均出現(xiàn)一過(guò)性的再灌注心律失常，表明竇房結(jié)組織存在再灌注損傷。隨著再灌注冠脈血流恢復(fù)，AA、AH間期均有不同程度的縮短，而HV間期仍未見(jiàn)明顯變化。這提示缺血時(shí)竇房結(jié)的電生理功能障礙與起搏基因HCN4密切相關(guān)，HCN4介導(dǎo)了緩慢性心律失常的發(fā)生。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往研究相一致，竇房結(jié)組織的HCN4異常表達(dá)可能導(dǎo)致竇房結(jié)功能障礙，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生[22]。竇房結(jié)組織HCN4表達(dá)降低可出現(xiàn)不同程度的竇性心動(dòng)過(guò)緩；在竇房結(jié)內(nèi)上調(diào)HCN4，可減少緩慢性心律失常的發(fā)生[23，24]。

竇房結(jié)缺血損傷導(dǎo)致HCN4的減少是竇房結(jié)功能障礙的主要原因，而及時(shí)開(kāi)通閉塞的血管進(jìn)行再灌注有利上調(diào)HCN4，促進(jìn)竇房結(jié)功能的恢復(fù)，減少急性缺血所致緩慢性心律失常的發(fā)生。