劉暢 王華，2

1北京大學醫(yī)學部病理學系（北京100191）；2北京大學第三醫(yī)院病理科（北京100191）

骨及軟組織腫瘤主要指來源于人體間充質(zhì)的腫瘤。惡性骨及軟組織腫瘤一般統(tǒng)稱為肉瘤，多經(jīng)血道轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性肉瘤患者的總體生存率小于20%［1-2］。肉瘤的治療方法包括手術(shù)、放療和化療。然而，肉瘤演進的分子機制研究相對緩慢，轉(zhuǎn)移患者的治療效果不盡如人意［1-2］，因此對于肉瘤發(fā)生發(fā)展機制及其靶向藥物的研究非常必要。近年來發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中發(fā)揮重要作用，部分外泌體中的生物標志物可為腫瘤體液診斷和預(yù)后判斷提供幫助，并有望成為腫瘤治療的候選靶標［3-4］。這篇綜述將外泌體在不同肉瘤中的研究進行總結(jié)，并討論外泌體在肉瘤診斷和治療中的潛在價值。

1 外泌體概述

外泌體直徑為30～150 nm，由脂質(zhì)雙層膜包繞；膜相關(guān)的脂質(zhì)筏主要由膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和磷脂酰膽堿組成。外泌體胞質(zhì)內(nèi)含有親本細胞來源的多種成分，包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA 和蛋白質(zhì)［5］，其中蛋白質(zhì)包括膜轉(zhuǎn)運及其融合蛋白、與外泌體產(chǎn)生有關(guān)的蛋白質(zhì)（如內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體ESCRT）、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）表達蛋白、四跨膜蛋白超家族（tetraspanins）、熱休克蛋白以及不同細胞來源所特有的蛋白質(zhì)［3］。外泌體的形成過程分為三個階段：細胞膜內(nèi)陷形成胞內(nèi)體、胞內(nèi)體多囊泡化、多囊泡體與質(zhì)膜融合釋放外泌體。第一階段中，真核細胞首先內(nèi)吞形成早期內(nèi)體（early endosome），在高爾基體和ESCRT 等細胞器和蛋白的調(diào)控下逐漸成熟為晚期內(nèi)體（late endosome），晚期內(nèi)體的包膜通過內(nèi)向出芽作用，包裹特異分選的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，形成多個管腔囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），即外泌體前體。晚期內(nèi)體包含多個ILVs 后，即成為多泡體（multivesicular body，MVB）。MVB 在溶酶體中降解或以外泌體形式分泌到細胞外間隙［6］。

外泌體的分泌具有較復(fù)雜的調(diào)控機制，主要受外泌體中蛋白質(zhì)的調(diào)控，包括RAB 及其效應(yīng)分子、GTP 酶以及SNARE（soluble NSF-attachment protein receptor）蛋白家族。RAB家族由60多種GTP 酶組成，分別調(diào)節(jié)細胞內(nèi)囊泡運輸?shù)牟煌h(huán)節(jié)［7］。其中RAB11 是第一個被發(fā)現(xiàn)與外泌體分泌有關(guān)的RAB 家族成員，抑制RAB11，細胞產(chǎn)生的外泌體數(shù)量減少。此外，外泌體的分泌也可受其他因素影響，如細胞內(nèi)Ca2+、乙酰肝素酶的表達或微環(huán)境中pH 值［7］。外泌體遷移到受體細胞的過程可能依賴于三種機制：細胞表面受體與外泌體相互作用、外泌體直接與細胞膜融合內(nèi)化、外泌體通過內(nèi)吞作用進入受體細胞［6］。外泌體內(nèi)化除了通過表面蛋白質(zhì)的配體與受體結(jié)合來實現(xiàn)外，還可以通過膜上的脂質(zhì)成分來協(xié)助細胞間通訊傳導并完成內(nèi)化［8］。

人體多種細胞可產(chǎn)生外泌體，從血液、唾液、尿液等體液中均可檢測到外泌體［9］。常用的外泌體提取方法有超速離心法、密度梯度離心法、尺寸排阻法、聚合物沉淀法和膜親和法等。其中，超速/密度梯度離心法是分離外泌體較常用的技術(shù)，成本較低，但其離心功效取決于樣品密度等理化性質(zhì)。通過透射電子顯微鏡、Nanosight 或流式細胞術(shù)可以檢測外泌體的大小、含量及質(zhì)量。此外，可調(diào)電阻脈沖傳感技術(shù)或納米顆粒追蹤分析技術(shù)可以測量外泌體的濃度和粒徑。外泌體中具有相對特異性的膜相關(guān)蛋白（如CD9、CD63、CD81 和CD82 等跨膜蛋白）、ESCRT、TSG101、熱休克蛋白（如Hsp70 和Hsp90）、黏附分子（如整合蛋白）和膜聯(lián)蛋白等，可通過Western blotting 驗證這些蛋白標記物［3］。

2 外泌體與骨及軟組織腫瘤

2.1 外泌體在骨及軟組織腫瘤發(fā)生發(fā)展和分化中的作用腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體在其生長和分化中發(fā)揮重要作用。VENTURA等［10］從培養(yǎng)的尤因肉瘤細胞外泌體中檢測到CD99 的表達，而CD99 參與了尤因肉瘤細胞分化、遷移和凋亡過程的調(diào)控。CD99 和特異性融合蛋白EWS-FLI1 可通過NF-κB信號傳導通路對尤因肉瘤細胞的分化產(chǎn)生拮抗作用。在CD99 沉默的尤因肉瘤細胞來源的外泌體中，CD99 表達缺失，但miR-34a 含量增多，將這種外泌體轉(zhuǎn)染到尤因肉瘤親本細胞中，可以下調(diào)親本細胞中Notch1/3 的表達，影響NF-kB 的轉(zhuǎn)錄活性，抑制腫瘤細胞的生長和遷移［10］。DE FEO 等［11］的研究進一步發(fā)現(xiàn)，CD99 沉默的尤因肉瘤細胞產(chǎn)生的外泌體中miR-199a-3p 增多，miR-199a-3p 在野生型尤因肉瘤細胞系中通過Jun/Fos 通路降低AP-1 轉(zhuǎn)錄因子水平，而AP-1 和NF-kB 活性降低后產(chǎn)生協(xié)同作用，可促進受體細胞的神經(jīng)分化，并抑制受體細胞的生長。GHAYAD 等［12］發(fā)現(xiàn)，橫紋肌肉瘤細胞比正常成纖維細胞和成肌細胞能產(chǎn)生更多的外泌體，且胚胎型和腺泡型橫紋肌肉瘤細胞分泌的外泌體均可誘導受體腫瘤細胞和正常成纖維細胞增殖，并促進成纖維細胞遷移、血管形成［12］。

2.2 外泌體在骨及軟組織腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移中的作用活化的間質(zhì)細胞通過釋放趨化因子和生長因子，使細胞外基質(zhì)（ECM）沉積、結(jié)締組織重新構(gòu)建，促進腫瘤細胞生長和侵襲，并可導致化療耐藥［13］。QI 等［14］研究表明，來自人骨髓間充質(zhì)細胞（hBMSC）產(chǎn)生的外泌體，可通過激活Hedgehog信號傳導途徑促進骨肉瘤細胞的生長。比較兩種外泌體內(nèi)容物，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞產(chǎn)生的外泌體中，miR-675 的含量比非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤明顯增加［5］，用此外泌體轉(zhuǎn)染成骨細胞HFOB1.19，后者CALN1 基因表達下調(diào)，細胞遷移和侵襲能力增加［5］，提示腫瘤分泌的外泌體可以作為信使在轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞和周圍細胞之間傳遞miRNA，重塑骨肉瘤中的微環(huán)境，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

RAIMONDI 等［2］采用骨肉瘤細胞來源的外泌體，處理小鼠單核巨噬細胞白血病Raw264 細胞，可以誘導Raw264 細胞形成多核巨細胞，并促進成熟破骨細胞樣細胞的骨吸收活性。用骨肉瘤細胞外泌體處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），發(fā)現(xiàn)HUVEC中促血管生成因子的表達增加，促進HUVEC形成新生血管。進一步研究發(fā)現(xiàn)，用骨肉瘤細胞來源的外泌體處理Raw264 和HUVEC 細胞后，均能檢測到miR-148a-3p 和miR-21-5p 表達增加，提示外泌體可通過特定的miRNA 影響受體細胞，促進破骨細胞和新生血管形成；兩種miRNA 在骨肉瘤組織樣本中的高表達均與預(yù)后不良有關(guān)。

卡波西肉瘤（kaposi sarcoma，KS）可攜帶相關(guān)皰疹病毒（KSHV）。HOSHINA 等［15］分離KS 病人及小鼠模型血漿中的外泌體，在這些外泌體中檢測到了KSHV 特異性miRNA；用這些外泌體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞遷移能力增強，IL-6 分泌增多，周圍血管生成潛力增加，肉瘤細胞生長加速，Ki67 陽性率顯著增高，提示KSHV 中的miRNA可以通過外泌體影響周圍細胞，反過來再影響腫瘤的進展。MCNAMARA 等［16］研究發(fā)現(xiàn)攜帶KSHV的外泌體可通過激活ERK1/2 通路來誘導HUVEC細胞的增殖與遷移，加速卡波西肉瘤的進程。含有KSHV 的外泌體長期轉(zhuǎn)染HUVEC，可以穩(wěn)定促進內(nèi)皮細胞重編程，對這些重編程的HUVEC 細胞進行基因表達譜分析，MCC、ARFGEF3 等67 種轉(zhuǎn)錄因子顯著上調(diào)，而DKK1、JUNB 等84 種轉(zhuǎn)錄因子顯著下調(diào)［16］，提示外泌體在卡波西肉瘤新生血管形成方面發(fā)揮了重要作用［16］。YOGEV 等［17］發(fā)現(xiàn)，受KSHV 感染的淋巴管內(nèi)皮細胞分泌的外泌體可將病毒miRNA 轉(zhuǎn)移到鄰近細胞中，并且可下調(diào)受體細胞靶基因表達，如抑制EGLN2 和HSPA9基因表達來促進有氧糖酵解，導致細胞產(chǎn)生有氧糖酵解，使其對KSHV 的敏感性降低，阻止KSHV進一步擴散，為KSHV 在微環(huán)境中的富集提供了條件。

腫瘤分泌的外泌體可以選擇性地將信息轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的受體細胞，改變局部微環(huán)境，調(diào)節(jié)受體細胞的相關(guān)通路，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。ENDO-MUNOZ 等［18］根據(jù)轉(zhuǎn)移特性分出一組骨肉瘤細胞系，在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS 中，尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）-尿激酶型纖溶酶原激活物受體（uPAR）軸的高表達與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)，且不依賴于Ras 基因的表達。對KHOS 細胞條件培養(yǎng)基進行超速離心，在外泌體沉淀和上清液中均檢測到uPA 的存在，證明uPA 以可溶形式分泌，并作為骨肉瘤分泌的細胞外囊泡（包括外泌體）的蛋白質(zhì)載體的一部分，通過uPA/uPAR/MAPK 軸激活MAPK 信號來促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移［18］。

BAGLIO 等［19］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞來源的外泌體可以通過激活間充質(zhì)干細胞（MSC）中的IL-6/STAT3通路促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，而這一過程可以被IL-6 阻斷劑逆轉(zhuǎn)［19］。WANG 等［20］發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAF）分泌的外泌體中miR-1228 上調(diào)，將CAF 來源的外泌體轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞，可以下調(diào)骨肉瘤細胞中的腫瘤細胞侵襲抑制因子（suppressor of cancer cell invasion，SCAI）的mRNA 和蛋白質(zhì)水平，促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。

唾液酸酶（NEU1）是細胞內(nèi)溶酶體胞吐作用的負向調(diào)節(jié)分子，而溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）則是該過程的活化分子。如果NEU1 缺乏，LAMP1 則保持高度唾液酸化并聚集在溶酶體膜上，使溶酶體易結(jié)合于質(zhì)膜上，有利于溶酶體的胞吐作用［21］。MACHADO 等［21］在橫紋肌肉瘤的研究中，比較了兩種人橫紋肌肉瘤RH41 和RH30 細胞系中NEU1和LAMP1 的表達情況，RH41 中NEU1 呈高表達而LAMP1 呈低表達，RH30 細胞則相反。在RH30 細胞中，發(fā)現(xiàn)較多的溶酶體結(jié)合于質(zhì)膜上，并顯示出明顯的胞吐現(xiàn)象。通過超速離心法分別提取兩種細胞的外泌體，發(fā)現(xiàn)RH30 細胞能產(chǎn)生更多的外泌體［21］，進一步在RH41 和RH30 細胞中分別敲低和過表達NEU1 或LAMP1 基因，可以通過下調(diào)NEU1 或上調(diào)LAMP1 表達來增強溶酶體胞吐作用和外泌體釋放。在RH30 細胞分泌的外泌體存在的情況下，RH41 細胞的侵襲能力增強，但沉默LAMP1 的RH30 細胞分泌的外泌體則對RH41 細胞沒有類似效果。為進一步探討橫紋肌肉瘤進展的機制［21］，在肉瘤細胞中下調(diào)NEU1、上調(diào)LAMP1 基因的表達，再進行基因表達陣列分析；結(jié)果顯示，肌球蛋白-11（MYH11）基因表達上調(diào)，并且MYH11可以與LAMP1 協(xié)同作用，促進溶酶體的胞吐作用。此外，溶酶體胞吐作用和外泌體釋放增加可以降解人和小鼠肉瘤細胞周圍的細胞外基質(zhì)，促進侵襲［21］，也提示外泌體在橫紋肌肉瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

2.3 外泌體在骨及軟組織腫瘤診斷及預(yù)后預(yù)測中的作用外泌體可以保護RNA 等內(nèi)容物免受人體血漿中RNA 酶的降解，使其在循環(huán)血中保持一定的穩(wěn)定性［22-23］。不同來源外泌體攜帶了親本細胞的核酸或蛋白質(zhì)信息，可以據(jù)此判斷來源腫瘤的類型，被認為是細胞外液或體液中理想的生物標志物。此外，外泌體產(chǎn)生的數(shù)量與某些腫瘤的惡性程度正相關(guān)，可輔助進行預(yù)后預(yù)測［9］。MILLER等［22］在尤因肉瘤細胞來源的外泌體中檢測到NROB1、NKX2.2、STEAP1、LIPI 及EWS-FLI1 融合基因等12 種潛在的分子標志物，qRT-PCR 結(jié)果驗證了上述基因在外泌體中的表達具有一定的特異性，其中EWS-FL1 融合基因的出現(xiàn)說明尤因肉瘤細胞分泌的外泌體中含有較完整的mRNA，可成為尤因肉瘤體液診斷及監(jiān)測的特異性分子標志物。在尤因肉瘤細胞外泌體中有超過1 200個轉(zhuǎn)錄物與對照組明顯不同，這些轉(zhuǎn)錄物在尤因肉瘤細胞衍生的外泌體中高度富集或減少，可能作為尤因肉瘤細胞和微環(huán)境通訊的相關(guān)介質(zhì)發(fā)揮作用［22］，其中部分有望成為鑒別診斷和預(yù)后判斷的候選分子標志物。

除特異性融合基因外，外泌體中的一些特異性蛋白和核酸也可以協(xié)助診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷［23］。FUJIWARA 等［4］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿外泌體中的miR-25-3p 的濃度顯著高于非骨肉瘤患者和健康志愿者。由于miR-25-3p 可以在外泌體中穩(wěn)定存在，因此檢測血漿中miR-25-3p 水平是區(qū)分骨肉瘤患者、非骨肉瘤患者或健康人群有效的生物標志物之一。此外，血漿miR-25-3p 水平與骨肉瘤患者的預(yù)后相關(guān)，miR-25-3p 水平越高，患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性越大，因此miR-25-3p 的血漿水平也可以作為骨肉瘤的預(yù)后判斷指標［4］。

有研究發(fā)現(xiàn)滑膜肉瘤來源的外泌體中miR-92b-3p 穩(wěn)定表達［24］，與對照組相比，miR-92b-3p 水平在滑膜肉瘤細胞系培養(yǎng)基中含量顯著增高，并與腫瘤細胞數(shù)量和培養(yǎng)時間呈正相關(guān)。在小鼠血清中發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p 水平與滑膜肉瘤大小有關(guān)。進一步對滑膜肉瘤患者和對照組的miR-92b-3p 水平進行分析，證實血清miR-92b-3p 水平與腫瘤大小相關(guān)；當腫瘤被切除和輔助化療后，血清miR-92b-3p 水平降低，但在局部復(fù)發(fā)或肺部轉(zhuǎn)移的患者中逐漸升高。由于主要存在于腫瘤細胞分泌的外泌體中的miR-92b-3p 比較穩(wěn)定，因此，循環(huán)血外泌體中的miR-92b-3p 可作為監(jiān)測滑膜肉瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新型生物標志物［24］。此外，與其他骨及軟組織腫瘤相比，miR-92b-3p 水平在滑膜肉瘤呈特異性上調(diào)，因此也可以用于與其他骨軟組織肉瘤的鑒別診斷［24］。

CASADEI等［25］發(fā)現(xiàn)脂肪肉瘤患者血漿中有3種miRNA（miR-25-3p、miR-451a、miR-92a-3p）表達上調(diào)，而miR-199a-3p 表達下調(diào)。進一步對比來自多個不同脂肪肉瘤細胞系和正常脂肪組織的外泌體miRNA［25］，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p 和miR-92a-3p 在所有脂肪肉瘤細胞系的外泌體中明顯上調(diào)。隨后將患者和健康組血漿中的外泌體進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p 和miR-92a-3p 在脂肪肉瘤患者血漿的外泌體中含量升高。當脂肪肉瘤細胞與外泌體抑制劑共培養(yǎng)時，miR-25-3p 和miR-92a-3p 的表達水平也降低，證明血漿中miR-25-3p和miR-92a-3p主要是脂肪肉瘤細胞通過外泌體產(chǎn)生的［25］，受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示［25］，這兩種miRNA特異性較高，有望成為新的脂肪肉瘤輔助診斷的分子標志物。

COLLETTI 等［26］發(fā)現(xiàn)促結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤（DSRCT）患者血漿外泌體中有55 種miRNA含量顯著不同，其中14 種miRNA 含量在至少1 例患者血漿外泌體中明顯不同，在3 例患者的血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)有3 種miRNA 表達上調(diào)（miR-34a-5p、miR-22-3p 和miR-324-5p）、2 種miRNA 表達下調(diào)（miR-150-5p 和miR-342-3p），說明富含miRNA的血漿外泌體可成為DSRCT 患者潛在的輔助診斷標志物。

液體活檢具有微創(chuàng)、快速、容易重復(fù)等優(yōu)點，從血液、尿液、唾液或腦脊液中分析游離核酸、可溶性蛋白質(zhì)等已成為腫瘤活檢的重要輔助檢測方法［27］。與組織活檢相比，液體活檢可以更好地監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、預(yù)測化療后反應(yīng)、實時了解腫瘤耐藥演變、確定靶向治療的方向［9］。由于外泌體中富含腫瘤細胞來源或衍生的各種蛋白質(zhì)、核酸等成分，將成為液體活檢又一新的方向［3］。

2.4 外泌體在骨及軟組織腫瘤治療中的作用

2.4.1 外泌體與骨及軟組織腫瘤的免疫治療由于外泌體含有來自腫瘤細胞的抗原并參與免疫應(yīng)答，所以外泌體可能成為免疫治療的靶標。TSUNO 等［28］發(fā)現(xiàn)，滑膜肉瘤SW982 細胞系的外泌體中含有的蛋白質(zhì)數(shù)量大約是親本細胞的三分之一。用柳氮磺吡啶（SASP）和甲氨蝶呤（MTX）處理后，SW982 細胞來源的外泌體和親本細胞的蛋白質(zhì)譜變化明顯不同；表明外泌體中的內(nèi)容物不僅僅是親代細胞的簡單輸出［28］，而是在形成和分泌過程中發(fā)生了不同程度的變化。SASP 和MTX 通過抑制IL-1β可以影響SW982 細胞外泌體的蛋白質(zhì)譜構(gòu)成。在外泌體中觀察到兩種發(fā)生變化的功能組蛋白質(zhì)，一種為免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白，包括與免疫抑制相關(guān)的蛋白，如Ras 相關(guān)蛋白Rab-7b、GTP 結(jié)合核蛋白Ran；另一種為氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，如3-磷酸甘油醛脫氫酶、NAD（P）H 脫氫酶1、硫氧還蛋白相互作用蛋白；其中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白對細胞的氧化應(yīng)激具有保護作用。外泌體中的這兩組蛋白質(zhì)中的部分可在IL-1β的作用下含量降低，SASP 和MTX 則可通過抑制IL-1β使這些蛋白含量增加，其中的免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白可有望成為未來免疫治療的候選靶標［28］。

2.4.2 外泌體與藥物呈遞系統(tǒng)將外泌體用于腫瘤藥物治療的載體傳遞系統(tǒng)已成為外泌體研究的一大熱點。相對于脂質(zhì)體和基于蛋白質(zhì)的納米粒子，外泌體具有如下優(yōu)勢：（1）體內(nèi)分布廣泛，具有明顯生物相容性，可將藥物直接裝載在經(jīng)過純化的外泌體中，并且親脂性和親水性物質(zhì)均可以通過不同的方法加載到外泌體中；（2）可對生物源性或合成物質(zhì)的藥物進行分類遞送；（3）選擇合適親本細胞釋放的外泌體可以優(yōu)先被特定受體細胞內(nèi)化［29］；（4）選擇特異性外泌體膜修飾蛋白或脂質(zhì)可以使其被特定的靶細胞內(nèi)化［8］；（5）可以在外泌體產(chǎn)生和分泌過程中完成靶向遞送，如將藥物注入親本細胞內(nèi)，或?qū)⒅委熡玫腄NA 轉(zhuǎn)染親本細胞，所產(chǎn)生的外泌體中即含有相應(yīng)的藥物；理想的親本細胞可以分泌大量攜帶藥物的外泌體，這些外泌體不僅可以誘導非免疫應(yīng)答，還可以靶向定位于特定的受體細胞。

SHIMBO 等［30］發(fā) 現(xiàn) 在轉(zhuǎn)染miR-143 的MSC 的條件培養(yǎng)基中，骨肉瘤細胞中miR-143 的表達水平顯著增高，細胞遷移能力明顯降低，提示miR-143可以對骨肉瘤細胞發(fā)揮抑制作用。通過超速離心法分離轉(zhuǎn)染后MSC 的條件培養(yǎng)基中的外泌體，與單純的條件培養(yǎng)基進行比較，前者miR-143 的水平高于后者，提示細胞外液中多數(shù)miR-143 存在于外泌體中［30］。此外，與未被轉(zhuǎn)染的MSC 相比，轉(zhuǎn)染miR-143 后的MSC 細胞外囊泡分泌量更高；并且從這種培養(yǎng)基中分離出的外泌體或未分離的條件培養(yǎng)基均可以抑制骨肉瘤細胞的遷移能力，但去除外泌體的條件培養(yǎng)基中未能觀察到143B 細胞遷移受到抑制的現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示細胞外miR-143 主要位于外泌體中并發(fā)揮抑制作用［30］。外泌體的遞送效率雖低于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，但外泌體遞送的毒性反應(yīng)較小，抑制腫瘤遷移的效應(yīng)相似。推測外泌體中的miR-143 可能被整合到其他復(fù)合物（如Ago2 蛋白）中，并被有效地轉(zhuǎn)送至受體細胞相應(yīng)位置，直接作用于靶點，提高了miR-143 的利用效率［30］。外泌體作為潛在的藥物呈遞系統(tǒng)的作用機制還在進一步研究中。

WEI 等［29］從骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSC）中分離出外泌體，將其與鹽酸阿霉素（Dox-HCl）混合，用三乙胺和磷酸緩沖鹽溶液（PBS）處理后，獲取裝載阿霉素（Dox）的外泌體（Exo-Dox）。透射電子顯微鏡顯示Exo-Dox 有明顯的外泌體結(jié)構(gòu)。用納米顆粒追蹤分析，發(fā)現(xiàn)裝載Dox 前，外泌體直徑為112.4 nm 左右，裝載Dox 后，外泌體直徑增大為152.7 nm 左右，-20 ℃培養(yǎng)7 d，Exo-Dox 的大小無明顯變化［29］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可以加速Exo-Dox 的Dox 釋放，而腫瘤細胞中的晚期內(nèi)體和溶酶體往往呈嗜酸性，提示Exo-Dox 可能成為有效的治療腫瘤的靶向藥物［29］。由于Dox 的主要副作用是心臟毒性，用游離Dox 和Exo-Dox 分別轉(zhuǎn)染心肌細胞系，發(fā)現(xiàn)進入心肌細胞中的Exo-Dox 數(shù)量比游離Dox 明顯減少，反之，Exo-Dox 進入到骨肉瘤細胞核中的數(shù)量明顯多于對照組，提示Exo-Dox 可以更加有效地進入腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用，而對心肌細胞的毒性較小。此外，將BM-MSC 產(chǎn)生的外泌體與骨肉瘤細胞和心肌細胞共培養(yǎng)24 h，細胞活力仍保存92%，證明外泌體有較好的細胞相容性［29］，并提示從BM-MSC 分離出的外泌體適合作為藥物載體運載化療藥物。

2.4.3 外泌體與化療效果評估、腫瘤耐藥外泌體中部分miRNA 的含量可隨化療效果發(fā)生改變。XU 等［1］分析了骨肉瘤患者化療中的外泌體miRNA 變化情況，發(fā)現(xiàn)部分miRNA 的表達隨著化療效果不同而有所不同。如化療效果差時，外泌體中的miR-124、miR-133a、miR-135b、miR-148a、miR-199a-3p、miR-27a、miR-385 和miR-9 等的含量下降。因此，骨肉瘤外泌體miRNA 有望作為判斷化療效果的生物標志物，并據(jù)此來制定和重新評估化療方案。

外泌體分泌的某些物質(zhì)也可促進腫瘤細胞之間的耐藥性轉(zhuǎn)移。TORREGGIANI 等［31］分離出具有多重耐藥性的人骨肉瘤細胞MG-63DXR30 的外泌體（Exo/DXR）、無耐藥性的MG-63 細胞的外泌體（Exo/S）。用Exo/DXR 感染骨肉瘤細胞可降低細胞對阿霉素的敏感性，而用Exo/S 感染骨肉瘤細胞則不會改變細胞對阿霉素的敏感性［31］。此外，具有阿霉素抗性的骨肉瘤細胞產(chǎn)生的外泌體可以被攝入無藥物抗性的MG-63 細胞，并誘導受體細胞出現(xiàn)阿霉素抗性的表型。P-糖蛋白（P-gp）是一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，它是MDR-1 基因編碼的ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運體的成員，可依賴ATP 將細胞內(nèi)藥物排出，使細胞內(nèi)藥物濃度降低，腫瘤細胞繼續(xù)存活。Exo/DXR與Exo/S 相比，前者表達更高水平的MDR-1 mRNA和P-gp，而被Exo/DXR 轉(zhuǎn)染后，MG-63 細胞中MDR-1 mRNA 和P-gp 表達水平均升高［31］，提示外泌體可以通過其內(nèi)在的mRNA 或蛋白質(zhì)介導腫瘤細胞的耐藥性轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)語與展望

大多數(shù)骨及軟組織腫瘤的發(fā)病機制還不十分明確，尚無有效的靶向治療藥物。近年來，外泌體在骨及軟組織腫瘤中的研究日趨增多，包括外泌體在肉瘤發(fā)生發(fā)展、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、靶向治療和輔助診斷中的作用，這些研究為揭示骨及軟組織腫瘤的演進機制和潛在治療方式提供了重要線索。未來關(guān)于外泌體的研究可能集中在以下幾個方面：（1）繼續(xù)深入了解外泌體的生物學結(jié)構(gòu)、內(nèi)容物和分泌方式；（2）尋找更為簡捷、有效的純化和檢測外泌體的方法；（3）建立能反映病理生理狀態(tài)下外泌體功能研究的條件；（4）明確外泌體用于體液活檢、并作為診斷和預(yù)后預(yù)測指標的可行性；（5）優(yōu)化外泌體的靶向輸送系統(tǒng)，尋找有效途徑使外泌體與其他抗腫瘤藥物協(xié)同發(fā)揮作用。對外泌體的深入研究，將為骨及軟組織腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療等帶來新的方向。