郭斌 于桑桑 顧蓓

惡性腫瘤是威脅人類健康的第一殺手，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，每年約有700萬人死于惡性腫瘤；據(jù)統(tǒng)計，2018年全球約有210萬女性乳腺癌新發(fā)病例，約占女性惡性腫瘤新發(fā)病例的25%[1]。目前，手術(shù)切除是乳腺癌治療的最有效治療手段之一，尋找有效的評估患者術(shù)后預(yù)后的生物靶標(biāo)是乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。微小RNA（microRNA，miR）在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、血管生成、侵襲、化療耐藥等過程中具有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中存在多種異常表達(dá)的miR發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，如miR-424抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[2]，miR-1297促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲[3]。朱麗華等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-23a檢測有助于胃癌診斷、預(yù)后判斷，Eissa等[5]證實(shí)miR-23a在乳腺癌中發(fā)揮促癌基因作用，并可通過直接激活癌基因叉頭蛋白M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）和富組氨酸糖蛋白（histidine rich glyco,HRG）基因表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌惡性進(jìn)展。miR-1247-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miR，其在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌基因功能[6]，而miR-1247-5p在乳腺癌的相關(guān)研究甚少。鑒于此，本研究通過檢測乳腺癌組織中miR-23a、miR-1247-5p的表達(dá)水平，探討其表達(dá)與患者臨床病理特征、術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年1月至2013年12月在昆山市第二人民醫(yī)院行乳腺切除手術(shù)的150例乳腺癌患者為研究對象，均為女性，年齡 26～73（54.36±9.78）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有完整的病歷資料和隨訪資料；（2）術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并糖尿病等慢性疾??；（3）合并血液系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)疾病。收集患者手術(shù)切除的乳腺癌組織及配對的癌旁正常組織樣本用于miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平檢測。

1.2 方法 采用實(shí)時熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法檢測乳腺癌組織與癌旁正常組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平。取50～100 mg組織樣本、1 ml Trizol試劑，加入至電動勻漿器，勻漿約2 min，轉(zhuǎn)移勻漿液至EP管中，依次加入氯仿、異丙醇、乙醇，抽提組織樣本總RNA，RNase-free ddH2O溶解后，測定RNA純度及濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。參照SYBR Premix EX TaqTM試劑盒（大連生物工程有限公司）說明書，配制RT-PCR反應(yīng)體系，miR-23a、miR-1247-5p和U6引物（上海生工生物工程有限公司）序列如下：miR-23a正向引物為5′-GGG GAT CAC ATT GCC AGG-3′，反向引物為 5′-AGT GCG TGT CGT GGA GTC-3′；miR-1247-5p 正向引物為 5′-ACA CTC CAG CTG GGA CCC GTC CCG TTC GTC C-3′，反向引物為 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC G-3′；U6 正向引物為 5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC TAA AAT-3′，反向引物為 5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。RTPCR反應(yīng)條件如下，預(yù)變性：95℃，10 min；40個循環(huán)：95 ℃，15 s；57 ℃，30 s；72 ℃，30 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值表示，U6 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt公式計算miR-23a、miR-1247-5p相對表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較乳腺癌組織與癌旁正常組織miR-23a、miR-1247-5p 表達(dá)水平；（2）分析乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，及對患者預(yù)后的預(yù)測價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以 表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析miR-23a、miR-1247-5p對乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁正常組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平比較 乳腺癌組織miR-23a表達(dá)水平高于癌旁正常組織，miR-1247-5p表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系分析 乳腺癌組織miR-23a表達(dá)水平與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤部位、組織病理分級無關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤直徑、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。乳腺癌組織miR-1247-5p表達(dá)水平與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤部位、腫瘤直徑無關(guān)（均P＞0.05），與組織病理分級、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），見表2。

表1 乳腺癌組織與癌旁正常組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平比較

2.3 乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系分析 以乳腺癌組織miR-23a表達(dá)水平的中位數(shù)（1.58）為界，將乳腺癌患者分為miR-23a高表達(dá)組（74例）和miR-23a低表達(dá)組（76例）。生存曲線分析顯示，miR-23a低表達(dá)組患者的術(shù)后5年生存率為72.97%（54/74）、中位生存時間53.85個月，均分別高于miR-23a高表達(dá)組患者的46.05%（35/76）、42.58個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（log-rank χ2=13.302，P＜0.05）。以乳腺癌組織中miR-1247-5p表達(dá)水平的中位數(shù)（0.42）為界，將乳腺癌患者分為miR-1247-5p低表達(dá)組（76例）和miR-1247-5p高表達(dá)組（74例）。生存曲線分析顯示，miR-1247-5p高表達(dá)組患者術(shù)后5年生存率73.68%（56/76）、中位生存時間52.54個月，均分別高于miR-1247-5p低表達(dá)組患者的44.59%（33/74）、43.62個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（log-rank χ2=12.650，P＜0.05）。乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平與患者預(yù)后的生存曲線見圖1。

2.4 乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平對患者預(yù)后的預(yù)測價值分析 以術(shù)后5年存活的患者為陽性樣本（89例），以術(shù)后5年死亡的患者為陰性樣本（61例），建立ROC診斷分析模型。結(jié)果顯示：檢測miR-23a、miR-1247-5p對乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測的AUC分別為 0.709（95%CI：0.625～0.793）、0.690（95%CI：0.606～0.775），靈敏度分別為 0.812、0.749，特異度分別為 0.637、0.622，見圖 2、表 3。

表2 乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系分析

圖1 不同乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平患者生存曲線比較

圖2 乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p對患者預(yù)后預(yù)測價值的ROC曲線

表3 乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p對患者預(yù)后預(yù)測價值的ROC分析結(jié)果

3 討論

乳腺癌是源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，原位乳腺癌患者經(jīng)手術(shù)治療后的預(yù)后良好，但突破乳腺基底膜并伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，經(jīng)手術(shù)治療后的預(yù)后情況難以預(yù)估。尋找有效的評估乳腺癌患者術(shù)后預(yù)后的生物學(xué)靶標(biāo)成為乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。大量研究證實(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分級及分子分型等均與乳腺癌患者術(shù)后預(yù)后有關(guān)[7-8]，但上述指標(biāo)對患者無法進(jìn)行個體化地預(yù)測、評估預(yù)后。近年來分子生物學(xué)發(fā)展迅猛，大量miR分子被證實(shí)在預(yù)測、評估惡性腫瘤患者預(yù)后中具有靶分子的潛能。研究表明，miR-23a在不同的惡性腫瘤中的表達(dá)情況不一致，如在骨肉瘤[9]、惡性膠質(zhì)瘤[10]中表達(dá)降低，而在非小細(xì)胞肺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]中表達(dá)增加，表明miR-23a同時具有抑癌和促癌基因功能。

本研究RT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，乳腺癌組織中miR-23a表達(dá)水平增加，提示miR-23a可能在乳腺癌變過程中發(fā)揮促癌基因作用；Chen等[13]發(fā)現(xiàn)Lumina乳腺癌細(xì)胞中，miR-23a調(diào)節(jié)X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）介導(dǎo)的細(xì)胞自噬過程，促進(jìn)細(xì)胞存活和侵襲。Ma等[14]證實(shí)miR-23a通過直接靶向調(diào)節(jié)CDH1基因表達(dá)和激活Wnt/βcatenin信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1） 誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）和腫瘤侵襲過程，本研究發(fā)現(xiàn)miR-23a表達(dá)與乳腺癌的腫瘤直徑、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，表明miR-23a可能在乳腺癌細(xì)胞增殖、雌激素受體/孕激素受體/人類表皮生長因子受體2分子表達(dá)、EMT等病理過程發(fā)揮作用。

有研究表明，miR-1247-5p在皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖、侵襲過程中發(fā)揮抑癌基因作用[15]，而miR-1247-5p在去勢耐藥前列腺癌中表達(dá)增加，發(fā)揮促癌基因功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1247-5p表達(dá)降低，且其表達(dá)與組織病理分級、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，初步表明miR-1247-5p在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，且可能參與乳腺癌細(xì)胞分化、增殖及轉(zhuǎn)移等過程。Zhang等[17]研究結(jié)果表明，乳腺癌中miR-1247-5p低表達(dá)與較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良病理分化和分子分型有關(guān)，且被證實(shí)可能是通過DVL1/Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖[18]，與本研究結(jié)論一致。

本研究生存曲線分析顯示，與miR-23a低表達(dá)、miR-1247-5p高表達(dá)患者相比，miR-23a高表達(dá)、miR-1247-5p低表達(dá)患者的術(shù)后預(yù)后較差。Zeng等[18]發(fā)現(xiàn)miR-1247-5p低表達(dá)與乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)，Ahmad 等[19]發(fā)現(xiàn) miR-23a～27a～24-2 基因簇與乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)。此外，ROC曲線分析顯示，乳腺癌組織miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平對患者預(yù)后預(yù)測的靈敏度、特異度均較高，提示miR-23a、miR-1247-5p表達(dá)水平檢測在乳腺癌預(yù)后判斷中具有較好的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，乳腺癌組織miR-23a表達(dá)上調(diào)，miR-1247-5p表達(dá)下調(diào)，且均可能在乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲等過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，檢測該兩指標(biāo)有助于預(yù)測患者術(shù)后預(yù)后。