史慶豐，黃英男，孫 偉，崔揚文，胡必杰,，高曉東

(復旦大學附屬中山醫(yī)院 1. 感染管理科； 2. 感染科，上海 200032)

肺炎克雷伯菌是一種可以導致社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染的常見致病菌，可無癥狀定植于正常人群呼吸道和腸道，并可廣泛分布于水生環(huán)境中，尤其以醫(yī)院重癥監(jiān)護病房(intensive care unit, ICU)分離和報道最為多見[1]。近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，我國住院患者送檢標本中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的分離率呈上升趨勢[2]，其感染可造成26%～44%的歸因死亡[3]。ICU環(huán)境物體表面以及診療設(shè)備作為醫(yī)務(wù)人員手最頻繁接觸的地方，也是多重耐藥菌最容易定植和傳播的關(guān)鍵場所。本次研究對某綜合醫(yī)院多個外科ICU進行環(huán)境采樣，分析ICU CRKP污染現(xiàn)狀并初步探討其環(huán)境流行的特點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 mSuper CARBA顯色培養(yǎng)基(江蘇科馬嘉微生物技術(shù)有限公司)，滅菌棉簽，無菌PBS緩沖液，MALDI-TOF質(zhì)譜儀，PCR Master Mix試劑盒(美國Thermo公司)，D2000 DNA marker(北京天根生化科技有限公司)，PCR儀(美國Bio-rad公司)，電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 采樣地點 選取某三級綜合醫(yī)院5個外科ICU(急診ICU、心外ICU、肝外ICU、大外科ICU、外科ICU A)進行環(huán)境采樣，所有ICU采樣點均在近期檢出過CRKP患者的病床周圍。采樣前未通知相關(guān)科室，采樣時間為工作日10:00左右，所采病區(qū)均已完成當日常規(guī)環(huán)境清潔消毒。

1.3 采樣方法 使用浸有PBS的無菌棉簽，對以下地點進行采樣：①選取床欄、呼吸機面板、聽診器、枕頭等醫(yī)務(wù)人員床旁高頻接觸的物體表面；②治療桌表面、手持機表面，病房公用電腦鍵盤、藥品存儲柜的把手、治療車把手；③選取洗手池壁、排水孔，治療室洗手池壁、排水孔，污物間拖把清洗池壁、排水孔，污物排放池壁、排水孔；④護理CRKP定植/感染患者的護工工作服領(lǐng)口、袖口、口袋口等。按照《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》[4]要求進行采樣：規(guī)則或平整表面使用棉簽采集面積5 cm×5 cm的區(qū)域，不規(guī)則或不平整的物體表面使用無菌棉簽直接涂抹采樣。將采樣好的棉拭子放置于含有中和劑的試管中保存并轉(zhuǎn)移。將已采樣的棉拭子在mSuper CARBA顯色培養(yǎng)基平血上反復均勻涂抹5次將平血置37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

1.4 碳青霉烯酶鑒定 根據(jù)顯色培養(yǎng)基說明書，挑取金屬藍色、深藍色的細菌菌落使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行菌種鑒定。使用雙紙片協(xié)同法聯(lián)合EDTA-Na2對過夜培養(yǎng)的細菌進行碳青霉烯酶表型鑒定。

1.5 DNA提取 使用接種環(huán)挑取碳青霉烯酶表型陽性的4～5個純菌落轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，加入1 mL無菌雙蒸水，震蕩混勻后懸于100℃加熱儀中裂解30 min。取出離心管，13 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于新EP管中，作為PCR試驗細菌DNA模板。

1.6 產(chǎn)碳青霉烯酶基因的檢測 KPC和NDM引物序列見表1[5]，由上海生工生物技術(shù)公司合成。選用含KPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1705作為KPC陽性對照，不含KPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1706作為陰性對照。臨床分離且NDM耐藥基因陽性的肺炎克雷伯菌株作為NDM陽性對照，臨床分離且NDM鑒定陰性的肺炎克雷伯菌株作為陰性對照。PCR反應(yīng)體系上下游引物各1 μL，DNA模版2 μL，雙蒸水21 μL。擴增條件均為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共計35個循環(huán)，最后72℃循環(huán)10 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，電泳30 min后在凝膠成像系統(tǒng)上閱讀結(jié)果。

表1 碳青霉烯酶耐藥基因引物序列和產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 采樣結(jié)果

2.1.1 床旁高頻接觸物表采樣結(jié)果 床旁共計采樣73份，其中床欄27份，聽診器9份，呼吸機面板28份，枕頭9份。心外ICU床欄處分離1株CRKP，其余采樣點均未分離到CRKP菌株。見表2。

表2 床旁高頻接觸物體表面CRKP檢出情況(陽性標本數(shù)/采樣標本數(shù))

2.1.2 公共區(qū)域采樣結(jié)果 公共區(qū)域共計采樣89份，其中治療桌33份，手持機29份，電腦鍵盤11份，儲物柜把手9份，治療車把手7分。外科ICU A某床手持機分離到1株CRKP，其余采樣點未分離到CRKP。見表3。

表3 公共區(qū)域環(huán)境CRKP檢出情況(陽性標本數(shù)/采樣標本數(shù))

2.1.3 水池采樣結(jié)果 ICU水池共計采樣59份，其中30份分離出CRKP。主要分離于洗手池孔、治療室水池孔、污物傾倒池壁和池孔。見表4。

表4 ICU水池CRKP檢出情況(陽性標本數(shù)/采樣標本數(shù))

2.1.4 護工衣物采樣結(jié)果 對CRKP定植/感染患者護理的8名護工進行采樣，1名肝外ICU護工袖口處分離到CRKP，其余采樣點未分離到CRKP。見表5。

表5 護工衣物CRKP檢出情況(陽性標本數(shù)/采樣標本數(shù))

2.2 碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果 碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果顯示，28株CRKP中5株產(chǎn)A類酶，11株產(chǎn)B類金屬酶。見表6。其中心外ICU床欄分離的1株CRKP以及水池孔分離的2株CRKP同時產(chǎn)A類酶和B類酶。

表6 28株CRKP碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果

2.3 碳青霉烯酶耐藥基因鑒定結(jié)果 PCR檢測結(jié)果顯示，2株CRKP攜帶KPC型耐藥基因，3株CRKP攜帶NDM型耐藥基因。其中心外ICU床欄分離的CRKP同時攜帶KPC和NDM耐藥基因。見圖1。

注：M為DL 2000 DNA Marker; Marker左側(cè)為KPC耐藥基因PCR結(jié)果，其中1泳道標本來自心外ICU床欄分離標本，2泳道標本來自肝外ICU護工袖口，3～5號來自水池孔標本，6號為KPC陰性對照(肺炎克雷伯菌ATCC 1706)，7號為KPC陽性對照(肺炎克雷伯菌ATCC 1705)。Marker右側(cè)號為NDM耐藥基因PCR結(jié)果，其中1號泳道標本來自心外ICU床欄分離標本，5號標本分離自外科ICU A手持機，12號為NDM陰性對照，13號為NDM陽性對照標本，剩余樣本分離自ICU洗手池。

3 討論

近年來，CRKP呈現(xiàn)全球廣泛流行的趨勢，正常人可通過食物攝取使其在胃腸道無癥狀定植[6-8]。國外研究已證實，50%耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteria，CRE)定植患者可在住院30 d內(nèi)發(fā)展為CRE感染，其感染風險是非定植患者的10.8倍。然而同源分析顯示，其中僅1例患者的腸道定植菌與感染菌同種同源，提示醫(yī)務(wù)人員和ICU周邊環(huán)境在CRE傳播中起到關(guān)鍵作用[9]。國內(nèi)外多項研究指出，CRKP在ICU暴發(fā)或流行期間，加強醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生、環(huán)境清潔和消毒以及進行隔離可有效降低相關(guān)感染的發(fā)生[10-11]，但研究多聚焦于醫(yī)院感染預(yù)防措施和臨床結(jié)局，對相關(guān)環(huán)境污染的調(diào)查較為少見。盡管國內(nèi)相關(guān)規(guī)范和醫(yī)院標準操作流程已對環(huán)境清潔和消毒的頻次、消毒劑的濃度以及擦拭順序進行了詳盡的指導，但仍無法杜絕CRKP在ICU的流行，提示日常環(huán)境清潔和消毒可能存在盲點。

本研究使用mSuper CARBA顯色培養(yǎng)基進行環(huán)境CRKP篩查，該培養(yǎng)基含有碳青霉烯類抗生素，可有效抑制對β-內(nèi)酰胺酶敏感，產(chǎn)ESBLs、Ampc酶細菌的生長，CRKP菌株在接種24 h后會顯示金屬藍色或深藍色。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行菌種鑒定后，可較為準確識別環(huán)境中的CRKP。本次采樣未能在CRKP患者床單元的高頻接觸物體表面，如床欄、呼吸機面板、聽診器、患者使用的枕頭分離到CRKP，同時公共區(qū)域內(nèi)的高頻接觸物體表面，如治療桌面、手持機、電腦鍵盤、存儲柜把手以及治療車把手上也未能分離到CRKP，與廖睿純等[12]的研究結(jié)論類似，可能與本次采樣前各ICU病區(qū)已完成常規(guī)環(huán)境清潔和消毒，且工勤人員執(zhí)行情況較好有關(guān)。

研究證實水龍頭可被大量奧斯陸莫拉菌污染，并伴隨噴濺的水污染周圍直徑約70 cm的區(qū)域[13]。水龍頭水直接流向水槽排水管或水槽內(nèi)表面的沖擊力會導致細菌擴散，對水龍頭上方10 cm處的空氣采樣發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌，達439 CFU/m3，或成為ICU潛在致病源[14]。水槽的深度可能是細菌傳播的關(guān)鍵因素，水槽深度>19 cm時細菌噴濺污染概率將大大增高[15]。本次采樣的5個洗手池與患者病床存在2～5 m的物理間距，但CRKP仍在洗手池孔、治療室水池孔、污物傾倒池壁和池孔大量定植。ICU洗手池除進行手衛(wèi)生外，偶爾還存在傾倒患者體液，沖洗患者使用過的儀器或器具等不當行為，可能是多重耐藥菌在水槽中廣泛定植的主要原因。盡管近5年的醫(yī)院監(jiān)測結(jié)果顯示，5個外科ICU未曾發(fā)生CRKP感染暴發(fā)事件，但有文獻報道顯示，由水槽所引起的CRE感染暴發(fā)平均持續(xù)時間為37個月，病例之間平均間隔可長達10.2個月，引起暴發(fā)的水槽存在清潔和消毒困難等問題[16]，更換水槽或管道后暴發(fā)終止[17-19]，給醫(yī)院感染的識別帶來巨大的挑戰(zhàn)。

產(chǎn)KPC酶和/或產(chǎn)NDM酶是我國25省市CRKP臨床分離株的主要耐藥機制，且2個耐藥基因攜帶率分別高達74%和17%，部分菌株同時攜帶有2種耐藥基因[20]。本研究結(jié)果顯示，水池分離的CRKP和高頻接觸的環(huán)境表面分離的CRKP菌株特征差異較大。研究[21]顯示，ICU管道污水和外部檢修孔采集的所有標本均含有產(chǎn)碳青霉烯酶的微生物，雖然環(huán)境中采集到的CRE與患者標本中采集的CRE在細菌種屬類別和藥物敏感性上均存在差異，但兩者存在密切的質(zhì)粒交換，考慮可能CRE主要在排水管中發(fā)生接合和重組，繼而通過環(huán)境清潔和醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生等行為導致住院患者發(fā)生感染，所以仍值得警惕和進一步研究。

本研究存在以下的局限：①未能對ICU所有可能污染的區(qū)域進行長期的、系統(tǒng)的采樣，對了解CRKP環(huán)境動態(tài)分布和傳播存在一定盲點；②僅重點關(guān)注CRKP的環(huán)境污染現(xiàn)狀，對醫(yī)務(wù)人員的手、衣物以及個人用品未進行采樣分析，對醫(yī)務(wù)人員在CRKP傳播中的媒介作用未能很好的分析；③受限于研究經(jīng)費和時間的影響，本研究尚未完成環(huán)境與臨床分離CRKP的同源性鑒定，因而未能明確護工袖口處分離的CRKP是否來源于所護理的患者，無法推測CRKP感染路徑。