歐陽鵬文，姜 斌，蔡 亮，王 娟，彭 娜，陶 寅，鄭淑娟，謝良伊

[1. 湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院)檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410005； 2. 湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)室，湖南 長沙 410005； 3. 湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院)呼吸內(nèi)科，湖南 長沙 410005]

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HvKP)是肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)高毒力變種，有別于引起機(jī)會性感染的經(jīng)典KP(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)，可引起既往體健和年輕者嚴(yán)重的社區(qū)獲得性感染，如肝膿腫、肺炎、腦膜炎和眼內(nèi)炎等[1-2]。自發(fā)現(xiàn)以來，HvKP的分子特征及毒力作用機(jī)制一直被廣泛研究，但目前為止仍缺乏嚴(yán)格定義。HvKP毒力因子主要位于一些毒力質(zhì)粒(如pLVPK)和可移動的遺傳原件[3-4]，莢膜多糖產(chǎn)生的上調(diào)(rmpA和/或rmpA2介導(dǎo))和鐵載體系統(tǒng)的過表達(dá)(如salmochelin 和 aerobactin)對HvKP的高毒力有著重要貢獻(xiàn)[5]。迄今為止，HvKP莢膜血清型大多數(shù)為K1或K2[6-7]，分布于一些特定的克隆譜系中，如ST23[2，8]。HvKP在全球的流行具有顯著的地域特征，主要分布于亞洲，特別是中國[9]。近年來，對于耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae， CR-HvKP)的報(bào)道不斷增加，且這些CR-HvKP以產(chǎn)KPC-2酶為主[2，10-11]。CR-HvKP因其高毒力和高耐藥性，嚴(yán)重威脅患者健康，加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給醫(yī)院感染的防控帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。為此，對1例由CR-HvKP引起的重癥肺炎患者病例資料及其分子、毒力特征進(jìn)行報(bào)告，旨在提高醫(yī)務(wù)人員對CR-HvKP及其致病特點(diǎn)的認(rèn)識。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者男性，87歲，無業(yè)，因“反復(fù)咳嗽、咳痰4月余，加重伴發(fā)熱、氣促1個(gè)月”就診于本院呼吸內(nèi)科。既往有高血壓、陳舊性肺結(jié)核病史和“風(fēng)濕病”史，8年前因“支氣管擴(kuò)張”行支氣管栓塞術(shù)，否認(rèn)糖尿病和外傷史，無吸煙和出游史。門診以“重癥肺炎”收治入院。入院后完善三大常規(guī)、肝腎功能、心肌酶、風(fēng)濕免疫檢查、心電圖、胸部CT、痰培養(yǎng)及支氣管鏡檢查等，并對分離代表株行進(jìn)一步研究。重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的指南[12]。將對碳青霉烯耐藥、含有毒力基因并且經(jīng)大蠟螟毒力模型評估具有高毒力的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)定義為CR-HvKP。

1.2 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 分離株通過VITEK MS(法國梅里埃)和VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)(法國梅里埃)進(jìn)行鑒定及抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)測定，其中亞胺培南、美羅培南(鄭州安圖生物)和替加環(huán)素(深圳康泰生物)MIC通過E-test法復(fù)核，粘菌素MIC采用微量肉湯稀釋法檢測。替加環(huán)素MIC結(jié)果判斷參照美國食品和藥物管理局(FDA)文件[13]，多粘菌素敏感性判斷參照歐洲臨床微生物和感染病學(xué)會藥敏委員會(EUCAST)文件[14]，其余抗菌藥物的敏感性判斷參照美國臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2018文件[15]。

1.3 碳青霉烯耐藥機(jī)制的檢測 采用耐藥表型和耐藥基因檢測法。耐藥表型檢測采用CLSI 2018文件推薦的改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)[15]。耐藥基因檢測采用PCR擴(kuò)增blaKPC、blaNDM和blaIMP三種常見的碳青霉烯酶基因[16]。菌株DNA提取采用煮沸法，PCR反應(yīng)體系包括引物F/R各0.2 μL，2×PCR super mixture(北京全式金)12.5 μL，DNA模板3 μL，加ddH2O至25 μL。引物序列及退火溫度見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性產(chǎn)物送長沙擎科生物技術(shù)公司測序并分析。

1.4 拉絲試驗(yàn) 采用拉絲試驗(yàn)確定該菌是否為高黏液表型[2]。將菌株接種至5%羊血培養(yǎng)基中，置于35℃ 5% 的CO2培養(yǎng)箱中孵育18～24 h后，用干燥的5 μL接種環(huán)輕輕挑取菌落，若拉絲>5 mm則判定為拉絲陽性，即為高黏液表型。

1.5 毒力基因、莢膜抗原基因檢測和多位點(diǎn)序列分型(MLST) 擴(kuò)增iucA、iroN、prmpA和prmpA2四種毒力基因確定菌株毒力基因表達(dá)情況[2]。擴(kuò)增所用的引物序列及退火溫度見表1，PCR反應(yīng)體系同1.3。通過多重PCR的方法檢測K1、K2、K5、K20、K54和K57毒力相關(guān)莢膜抗原基因了解該菌的莢膜抗原基因表達(dá)情況，檢測方法參照文獻(xiàn)[17]。根據(jù)Pasteur Institute MLST 網(wǎng)站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)提供的引物序列和條件對該菌進(jìn)行MLST。

表1 CR-HvKP碳青霉烯酶耐藥基因及毒力基因引物序列及退火溫度

1.6 動物模型毒力試驗(yàn) 采用大蠟螟模型了解CR-HvKP株菌在體外的毒力表現(xiàn)[2，18]。大蠟螟是鱗翅目、螟蛾科、蠟螟亞科、蠟螟屬的昆蟲。該幼蟲模型目前已成為研究許多人類病原體發(fā)病機(jī)制的可靠模型[2，18]。幼蟲在注射菌液后會產(chǎn)生免疫反應(yīng)并黑化(圖1)，失去運(yùn)動能力后死亡，通過觀察接種后幼蟲的死亡情況即可比較菌株的毒力大小[19]。將待測菌株經(jīng)35℃孵育過夜后，挑取單個(gè)菌落并用磷酸鹽緩沖液(PBS)分別調(diào)至1×104、1×105、1×106、1×107CFU/mL，然后采用微量注射器將各濃度菌液以10 μL/只的量注入體長2～3 cm活力較好的大蠟螟幼蟲(購自天津惠裕德公司)體內(nèi)，每間隔2 h觀察幼蟲死亡情況并記錄。每個(gè)濃度設(shè)10只平行試驗(yàn)。將HvKP菌株NTUH-K2044和非HvKP菌株ZR2以同樣的方式進(jìn)行試驗(yàn)并分別作為陽性對照組和陰性對照組，同時(shí)設(shè)置PBS空白對照組。試驗(yàn)重復(fù)至少2次。

A：未接種菌液的幼蟲；B：黑化并死亡的幼蟲。

2 結(jié)果

2.1 主要診治經(jīng)過 患者入院時(shí)反復(fù)咳嗽，咳淡黃色膿性痰，且痰不易咳出，并有呼吸困難，無明顯發(fā)熱，無盜汗及痰中帶血。體格檢查：體溫36.5℃，呼吸21次/min，脈搏79次/min，血壓122/76 mmHg。扶入病房，神志清楚，精神欠佳?？诖綗o發(fā)紺，雙肺呼吸音粗，右下肺可聞及中等濕啰音，心腹部查體未見異常。入院后予以吸氧、止咳化痰及改善通氣功能等對癥支持治療，并經(jīng)驗(yàn)性地予以頭孢哌酮/舒巴坦鈉(2 g,靜脈滴注，q6h)抗感染，患者咳嗽、氣促癥狀未見明顯改善。行胸部CT檢查示右上肺病變和雙下肺炎癥，進(jìn)一步完善纖維支氣管鏡檢查?；颊叻闻莨嘞匆号囵B(yǎng)分離出CR-HvKP1235，藥敏結(jié)果見表2。遂根據(jù)藥敏結(jié)果改用其敏感的鹽酸左氧氟沙星(0.3 g，靜脈滴注，q12h)和鹽酸多西環(huán)素(0.1 g，靜脈滴注，q12h)聯(lián)合抗感染，同時(shí)予以對癥支持治療。5日后患者咳嗽、呼吸困難癥狀得到明顯改善，無發(fā)熱、胸悶不適，肺部濕啰音較前明顯減少，各項(xiàng)生命體征平穩(wěn)，復(fù)查痰培養(yǎng)陰性，遂予出院。兩周后患者門診復(fù)查胸部CT提示肺部炎癥較前明顯好轉(zhuǎn)。

表2 CR-HvKP1235 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 碳青霉烯耐藥表型及基因型檢測結(jié)果 CR-HvKP1235 改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)結(jié)果為碳青霉烯酶陽性(抑菌圈直徑6 mm)。PCR擴(kuò)增檢測碳青霉烯基因結(jié)果顯示，該菌含有blaIMP-4，未檢測出blaKPC和blaNDM。見圖2。

M為Marker，A～C分別為CR-hvKP1235 blaKPC、陽性對照和陰性對照，D～F分別為CR-HvKP1235 blaNDM、陽性對照和陰性對照，G～I(xiàn)分別為CR-HvKP1235 blaIMP、陽性對照和陰性對照。

2.4 拉絲試驗(yàn)結(jié)果 CR-HvKP1235拉絲試驗(yàn)結(jié)果顯示，拉絲長度<5 mm，拉絲陰性，為非高黏液表型。

2.5 耐藥基因、毒力基因、莢膜抗原基因檢測和MLST結(jié)果 CR-HvKP1235僅prmpA2陽性，未檢出iucA、iroN和prmpA，莢膜抗原基因檢測提示含有K54莢膜抗原基因，MLST為ST2928型。見圖3。

M為Marker，A～C分別為CR-HvKP1235 iucA、陽性對照和陰性對照，D～F分別為CR-HvKP1235 iroN、陽性對照和陰性對照，G～I(xiàn)分別為CR-HvKP1235 prmpA、陽性對照和陰性對照，J～L分別為CR-HvKP1235 prmpA2、陽性對照和陰性對照。

2.6 動物模型毒力試驗(yàn)結(jié)果 選擇在菌液濃度為1×106CFU/mL時(shí)進(jìn)行各組間比較。PBS空白對照組幼蟲全部存活，CR-HvKP1235試驗(yàn)組幼蟲在接種菌液14 h后存活率低于NTUH-K2044高毒力KP組和ZR2非高毒力cKP組，表明該菌株在大蠟螟幼蟲毒力模型中表現(xiàn)出較高的毒力。見圖4。

圖4 CR-HvKP1235的大蠟螟感染模型試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

自1986年第1例HvKP引起的肝膿腫被報(bào)道以來，HvKP這一高毒力變種逐漸引起人們的重視[20]。以往報(bào)道的HvKP大多引起社區(qū)獲得性感染，并且常對多種抗菌藥物有較高的敏感性，但隨著抗菌藥物的大量使用及其他諸多因素的共同作用，近幾年CR-HvKP已廣泛出現(xiàn)，給醫(yī)院感染的預(yù)防和控制帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2，21]。隨著對HvKP毒力機(jī)制研究的深入，許多毒力相關(guān)因子已被發(fā)現(xiàn)，如高黏液表型、莢膜血清型、MLST型及包含毒力基因的毒力質(zhì)粒等[22]。雖然研究表明，peg-344、iroB、iucA、prmpA和prmpA2等毒力因子在鑒定HvKP時(shí)表現(xiàn)出較高的診斷正確性[5]，但目前仍缺乏精確區(qū)分HvKP和cKP的方法。為了解本地區(qū)KP的分子流行病學(xué)及毒力情況，為此對本院臨床微生物室分離的KP進(jìn)行了連續(xù)搜集并分析，發(fā)現(xiàn)了1株具有不常見的ST型和莢膜血清型的CRKP，經(jīng)進(jìn)一步研究最終鑒定為CR-HvKP。

本研究中感染CR-HvKP的患者為老年男性，合并有高血壓和支氣管擴(kuò)張病史，入院時(shí)精神差，雖未出現(xiàn)發(fā)熱，但有反復(fù)咳嗽、氣促的臨床表現(xiàn)，肺部炎癥范圍廣泛且遷延不愈。行纖維支氣管鏡檢查并送檢肺泡灌洗液培養(yǎng)為KP，且為多重耐藥菌，根據(jù)藥敏結(jié)果更改抗菌藥物并積極對癥支持治療后患者癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。老年患者的重癥肺炎表現(xiàn)可不典型，若早期未引起重視易導(dǎo)致難以挽回的結(jié)局[23]。本例患者無發(fā)熱，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白及降鈣素原等炎癥指標(biāo)均正常，血常規(guī)中性粒細(xì)胞比例升高，胸部CT發(fā)現(xiàn)雙下肺廣泛炎癥，臨床極易忽視和漏診。本次引起感染的病原菌為致病性較強(qiáng)并且對多種常用抗菌藥物具有較高耐藥性的KP，給臨床診治增加了一定的難度。及時(shí)完善纖維支氣管鏡檢查，明確病原菌并選擇恰當(dāng)?shù)目咕幬锸潜纠斡年P(guān)鍵。值得注意的是，CR-HvKP的典型感染癥狀是肝膿腫[24]，但該患者并未出現(xiàn)此種感染的表現(xiàn)。

本研究通過毒力基因和大蠟螟毒力模型兩種方法定義了CR-hvKP。以往報(bào)道中的CR-HvKP多屬于ST11，并且大多產(chǎn)KPC-2[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)的CR-hvKP屬于ST2928、莢膜抗原為K54型和產(chǎn)IMP-4碳青霉烯酶，ST2928 CR-HvKP目前尚未見報(bào)道，說明HvKP克隆譜系具有多樣性。雖然該株CR-HvKP在體外動物模型中表現(xiàn)了較高的毒力，但患者并未出現(xiàn)嚴(yán)重的結(jié)局，其原因目前尚不明確，菌株在體內(nèi)的毒力表現(xiàn)和宿主免疫之間的作用關(guān)系值得探究，相關(guān)結(jié)論需要更大樣本量和更深入研究數(shù)據(jù)的支持。由于研究的樣本十分有限，難以進(jìn)一步分析這種新型ST CR-HvKP的感染危險(xiǎn)因素或流行病學(xué)特征，同時(shí)對此株新型CR-HvKP的毒力基因背景了解也十分有限，但研究結(jié)果提示HvKP可能正在向新的克隆譜系進(jìn)化，提醒應(yīng)該更加密切關(guān)注CR-HvKP，需要更加積極地監(jiān)測此種病原體，以便為臨床醫(yī)生和流行病學(xué)家提供可靠的信息。在中國，CR-HvKP的報(bào)道正在增加，新的ST型出現(xiàn)令人擔(dān)憂，及早發(fā)現(xiàn)并隔離是控制此菌進(jìn)一步傳播的主要措施，同時(shí)，對CR-HvKP的毒力機(jī)制和耐藥性的發(fā)生需要進(jìn)行更深入地研究，以幫助臨床醫(yī)生應(yīng)對危機(jī)。