（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110005）

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一種進(jìn)行性、不可逆性、遺傳性視網(wǎng)膜疾?。?］。常表現(xiàn)為夜盲、視野缺損和漸進(jìn)性視力下降。RP一般先累及中周部視網(wǎng)膜，逐漸向后極部進(jìn)展。這是由于光感受器細(xì)胞中的視桿細(xì)胞最先發(fā)生凋亡，隨著疾病進(jìn)展，視錐細(xì)胞也逐漸死亡［2-3］。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)80種基因可導(dǎo)致RP。Spata7基因突變是導(dǎo)致早發(fā)型隱性遺傳RP的關(guān)鍵基因之一，可致光感受器細(xì)胞早期死亡［4-7］。SPATA7蛋白表達(dá)于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞中連接纖毛處，其突變導(dǎo)致光感受器細(xì)胞的連接纖毛破壞，引發(fā)光感受器細(xì)胞相關(guān)蛋白的內(nèi)節(jié)到外節(jié)的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙［8-9］。視紫紅質(zhì)蛋白（rhodopsin，RHO）位于光感受器細(xì)胞外節(jié)處，是維持光感受器細(xì)胞功能的重要蛋白。當(dāng)RHO合成后無(wú)法被轉(zhuǎn)運(yùn)到光感受器細(xì)胞外節(jié)時(shí)，會(huì)停留在光感受器細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），導(dǎo)致ER應(yīng)激，并發(fā)生光感受器細(xì)胞死亡［10-13］。部分RP是由于RHO在光感受器細(xì)胞ER內(nèi)的非正常折疊或運(yùn)輸障礙造成。由此推測(cè)Spata7基因突變可能導(dǎo)致RHO在ER內(nèi)聚集，發(fā)生ER應(yīng)激，導(dǎo)致光感受器細(xì)胞死亡。

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術(shù)是近年來(lái)用于基因敲除的基因編輯方法，多用于全身目的基因敲除［14-16］。本研究首次運(yùn)用腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）作為載體，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)搭載入視網(wǎng)膜，構(gòu)建Spata7視網(wǎng)膜內(nèi)敲除模型，驗(yàn)證了CRISPR/Cas9技術(shù)視網(wǎng)膜內(nèi)靶向敲除的有效性，并進(jìn)一步探討了Spata7基因在光感受器細(xì)胞中的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6基因背景的野生型小鼠在12 h光照和12 h暗適應(yīng)下飼養(yǎng)。本研究嚴(yán)格遵守ARVO關(guān)于在眼科和視覺(jué)研究中的動(dòng)物使用聲明，實(shí)驗(yàn)方案獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 AAV載體的構(gòu)建：運(yùn)用http：//crispr-era.stanford.edu網(wǎng)站進(jìn)行Spata7gRNA的設(shè)計(jì)，選取分?jǐn)?shù)最高的gRNA（GTTCTGGACTTCGCTGGAGG）。將Spata7gRNA克隆進(jìn)pTR-GRK1 AAV8載體，同時(shí)將GFP克隆入同一載體，形成AAV8-GRK1-GFP-Spata7gRNA結(jié)構(gòu)。將Cas9單獨(dú)克隆入另一載體，形成AAV8-GRKCas9載體結(jié)構(gòu)。AAV8-Spata7gRNA和AAV8-Cas9的病毒濃度分別為3.15×1013和3.45×1013vg/mL。

1.2.2 視網(wǎng)膜下注射：AAV8-Spata7gRNA-GFP與AAV8-Cas9按 1︰1混合。將出生14 d的小鼠分為2組，實(shí)驗(yàn)組右眼注射1 μL AAV混合液，左眼注射等量PBS，對(duì)照組左右眼均注射1 μL PBS，以對(duì)照注射本身對(duì)左右眼帶來(lái)的損傷。將小鼠麻醉后，用30號(hào)斜角針頭在角鞏膜緣睫狀體平坦部進(jìn)行淺穿刺，將35號(hào)鈍針引入玻璃體腔并向腹側(cè)推進(jìn)，直到針尖穿過(guò)視網(wǎng)膜，用超微量泵Ⅱ和Micro4控制器將病毒懸液注入視網(wǎng)膜下間隙。

1.2.3 視網(wǎng)膜電生理檢查：將小鼠置于暗室過(guò)夜后，在暗室內(nèi)行暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）檢查，采用6個(gè)閃光強(qiáng)度（-34，-24，-14，-4，0，10 dB）記錄a波和b波。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR：于注射1個(gè)月后摘取小鼠視網(wǎng)膜，三唑試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA，DNA酶Ⅰ（美國(guó)Invitrogen公司）處理，防止基因組DNA污染。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（美國(guó)Fisher Scientific公司）和StepOne實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國(guó)Invitrogen公司）測(cè)定敲除后Spata7的mRNA表達(dá)水平，并用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。Spata7上游引物序列為5’-TACCCGCCCATA AAGTCAAG-3’，下游引物序列為5’-CAGATGGGGA CAGTGATGTG-3’；GAPDH引物序列為5’-ACCCAG AAGACTGTGGATGG-3’，5’-CACATTGGGGGTAGG AACAC-3’。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)及HE染色：處死小鼠后，取眼球置入Davidson’s fixative溶液固定過(guò)夜，脫水、包埋、切片，制成7 μm厚切片。切片脫蠟后行抗原修復(fù)，冷卻后用1×PBS清洗。于0.5%TBS-Triton X中孵育20 min后，在含有10%山羊血清的緩沖液中室溫孵育1 h，加入1︰500雞抗GFP、1︰25小鼠抗Cas9、1︰500小鼠抗RHO抗體和1︰100兔抗CHOP，4 ℃孵育過(guò)夜。TBS洗滌，二抗（1︰500 Alexa Fluor?488結(jié)合山羊抗兔IgG、1︰500 Cy3?山羊抗鼠IgG、1︰500 Cy3?山羊抗雞IgG）室溫下孵育2 h。用1︰1 000 Topro3/DAPI和洗滌液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。最后，在載玻片上滴入長(zhǎng)效防污劑（美國(guó)Life Technologies公司）。石蠟切片HE染色，所有切片取材位置相同，為靠近視盤(pán)中央處。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Spata7體內(nèi)敲除后眼底照相

對(duì)AAV注射1個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行眼底照相，觀察小鼠的視網(wǎng)膜損傷情況以及GFP的表達(dá)情況。如圖1所示，在正常光頻道下，可見(jiàn)AAV注射眼視網(wǎng)膜鼻上方及顳上方血管弓附近視網(wǎng)膜色素上皮萎縮、邊界不清，視網(wǎng)膜鼻上方可見(jiàn)星狀白色增殖膜，病灶面積約占視網(wǎng)膜10%～20%，病灶內(nèi)繼發(fā)色素增殖呈斑駁樣，并伴有部分黃色滲出，視盤(pán)周圍血管紋理清晰，色澤正常。病灶周邊可見(jiàn)熒光著染，提示GFP在AAV注射眼視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。藍(lán)光下可見(jiàn)與PBS注射眼相比，AAV注射眼有大量的GFP表達(dá)，幾乎覆蓋整個(gè)視網(wǎng)膜，表達(dá)效率約為80%。說(shuō)明病毒注射成功，視網(wǎng)膜注射和病毒感染保持較高效率。

圖1 視網(wǎng)膜下腔注射1個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組小鼠眼底照相檢查結(jié)果Fig.1 Fundus imaging results of mice in experimental group one month after injection

根據(jù)小鼠視網(wǎng)膜眼底照相結(jié)果確定病毒感染成功后，取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠各4只行ERG，檢查注射后光感受器細(xì)胞的功能。結(jié)果如圖2所示，在不同光照強(qiáng)度下，對(duì)照組小鼠左右眼a波和b波數(shù)值接近（P＞0.05），且在正常數(shù)值范圍內(nèi)（在光強(qiáng)度為1 cd2/m2時(shí)，a波正常值為100～150 μV，b波正常值300～350 μV）。說(shuō)明視網(wǎng)膜下腔注射不會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷。而實(shí)驗(yàn)組小鼠在不同光照強(qiáng)度下，AAV注射眼a波和b波均明顯低于PBS對(duì)照眼，在光強(qiáng)度為1 cd2/m2時(shí)，a波降低約100 μV，b波降低約200 μV（P＜0.05），提示AAV注射眼光感受器細(xì)胞大量死亡。

2.2 Spata7基因體內(nèi)敲除的效率

將4只注射AAV 1個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)組小鼠處死，取視網(wǎng)膜行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，AAV注射眼Spata7的表達(dá)效率比PBS注射眼低54%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明1 μL AAV病毒/CRISPR系統(tǒng)混合液（濃度3×1013vg/mL）行一次性視網(wǎng)膜下腔注射對(duì)Spata7基因的敲除效率為54%。

2.3 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組（左右眼均注射PBS）左右眼視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層厚度一致且未見(jiàn)明顯細(xì)胞死亡。進(jìn)一步說(shuō)明了視網(wǎng)膜下腔注射不會(huì)對(duì)光感受器細(xì)胞產(chǎn)生大的損傷，且左右眼注射水平相對(duì)一致。而實(shí)驗(yàn)組小鼠AAV注射眼光感受器細(xì)胞層（外核層）明顯薄于PBS對(duì)照眼，意味著Spata7部分敲除后光感受器細(xì)胞大量死亡。

2.4 免疫熒光染色結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果顯示，GFP和Cas9蛋白的表達(dá)基本覆蓋整個(gè)視網(wǎng)膜，與眼底照相結(jié)果一致。AAV-Spata7-GFP-gRNA和AAV-Cas9病毒可感染同一光感受器細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)Spata7基因的敲除（圖4）。與PBS注射眼相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠AAV注射眼ER內(nèi)RHO大量表達(dá)于光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)，少量表達(dá)于外核層。同時(shí)，在AAV注射眼光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)中可見(jiàn)ER應(yīng)激標(biāo)記蛋白CHOP的表達(dá)（圖5）。

3 討論

圖2 視網(wǎng)膜下注射1個(gè)月后2組小鼠ERG檢查結(jié)果Fig.2 One month after sub-retinal injection，the results of ERG in the two groups were examined

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的HE染色結(jié)果Fig.3 HE Staining results of the mice in experimental and control groups

圖4 GFP與Cas9 蛋白的免疫熒光染色結(jié)果Fig.4 Immunofluorescence staining results of GFP and Cas9

圖5 RHO和CHOP免疫熒光染色結(jié)果Fig.5 Immunofluorescence staining results of RHO and CHOP

為了研究Spata7基因突變后光感受器細(xì)胞死亡的機(jī)制，本研究首次運(yùn)用AAV載體和視網(wǎng)膜下腔注射技術(shù)，在小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)建立了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)Spata7基因進(jìn)行視網(wǎng)膜內(nèi)特異性敲除。實(shí)驗(yàn)組小鼠眼底照相顯示GFP高表達(dá)，免疫熒光顯示GFP和Cas9蛋白廣泛表達(dá)，qRT-PCR顯示Spata7mRNA表達(dá)水平顯著降低，均表明AAV感染及Spata7視網(wǎng)膜內(nèi)敲除效率較高；實(shí)驗(yàn)組小鼠ERG a波和b波峰值顯著降低，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層（外核層）明顯變薄，表明光感受器細(xì)胞大量死亡，提示Spata7基因視網(wǎng)膜內(nèi)敲除模型建立成功。該模型的建立，對(duì)比傳統(tǒng)意義上利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Spata7基因敲除鼠，獲得的效果等同，即敲除后早期即發(fā)生光感受器細(xì)胞大量死亡。但本模型的優(yōu)勢(shì)在于定點(diǎn)敲除視網(wǎng)膜內(nèi)的Spata7基因，而全身其他器官的Spata7基因則被保留，因此，不影響小鼠發(fā)育及其他器官功能，尤其是公鼠的睪丸功能，保證了敲除鼠的生育能力。同時(shí)，該方法與利用Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建的選擇性敲除鼠相比，優(yōu)勢(shì)在于耗時(shí)少，方法簡(jiǎn)單，不需要進(jìn)行篩選［17-18］，既避免了全身敲除對(duì)小鼠其他器官功能帶來(lái)傷害，又大幅節(jié)省了研究時(shí)間，提高了研究效率。同為運(yùn)用AAV作為載體搭載CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入視網(wǎng)膜，另一研究團(tuán)隊(duì)用此方法對(duì)小鼠RHO基因進(jìn)行了敲除，但其AAV對(duì)視網(wǎng)膜的感染效率僅為30%，目的基因的敲除效率也隨之顯著降低［19］。而本研究通過(guò)改進(jìn)小鼠視網(wǎng)膜下腔注射的進(jìn)針角度，大幅提高了AAV感染效率。小鼠視網(wǎng)膜下腔注射常規(guī)進(jìn)針角度與水平面成45°，但本研究組發(fā)現(xiàn)由于出生14 d小鼠與成年鼠眼位有細(xì)微差別，導(dǎo)致斜行45°進(jìn)針并不能保證注射位點(diǎn)靠近視網(wǎng)膜后極部，從而導(dǎo)致AAV感染效率降低，故將進(jìn)針角度調(diào)高至75°～80°，保證了注射位點(diǎn)靠近后極部，大幅度提高了AAV對(duì)視網(wǎng)膜的感染效率（80%），保證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Spata7基因的有效敲除。

本研究對(duì)Spata7基因視網(wǎng)膜內(nèi)敲除1個(gè)月后光感受器細(xì)胞的死亡機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，RHO在實(shí)驗(yàn)組小鼠AAV注射眼光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)中呈高表達(dá)，提示RHO滯留在光感受器細(xì)胞ER內(nèi)。ER應(yīng)激標(biāo)記蛋白CHOP在小鼠AAV注射眼光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)中高表達(dá)，意味著RHO在ER內(nèi)的聚集引發(fā)了ER應(yīng)激。說(shuō)明視網(wǎng)膜內(nèi)敲除Spata7基因后，RHO不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到光感受器細(xì)胞外節(jié)，而停留在了ER，造成了ER應(yīng)激，導(dǎo)致光感受器細(xì)胞凋亡。

本研究也存在局限性：僅探討了AAV注射1個(gè)月后Spata7基因的敲除情況及敲除后的光感受器細(xì)胞死亡情況，關(guān)于AAV搭載的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Spata7基因的遠(yuǎn)期敲除效應(yīng)還有待繼續(xù)研究；僅對(duì)AAV注射眼和PBS對(duì)照眼的光感受器細(xì)胞死亡情況和RHO運(yùn)輸情況進(jìn)行了比較，未對(duì)AAV注射眼內(nèi)不同AAV注射效率區(qū)域之間進(jìn)行比較；Spata7視網(wǎng)膜內(nèi)的敲除效率還可進(jìn)一步提高。對(duì)此，可將常用的、分子量較大的SpCas9改為近年新發(fā)現(xiàn)的、分子量較小的SaCas9，使Cas9、gRNA和GFP 包裝進(jìn)入同一AAV載體，以克服AAV載體容量有限不能同時(shí)搭載這三者的局限性［20］，同時(shí)在此基礎(chǔ)上可設(shè)計(jì)多個(gè)gRNA同步定位Spata7基因，以提高敲除效率。