付金玲　曲志剛　左　玲　宋　丹　康治臣

(吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林　長春　130041)

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年齡對斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞密度的影響

付金玲曲志剛1左玲宋丹康治臣2

(吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林長春130041)

目的探討年齡對斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞密度的影響。方法利用JB-4福爾根組織學方法觀察和檢測3、15、27個月野生型斑馬魚視網(wǎng)膜不同區(qū)域、不同種類光感受器細胞的密度。結果隨斑馬魚年齡增長，在視網(wǎng)膜各個區(qū)域所有種類的光感受器細胞密度均逐漸下降。視網(wǎng)膜光感受器細胞密度總體區(qū)域性變化趨勢是：中央?yún)^(qū)細胞密度最大，從中央?yún)^(qū)到周邊區(qū)細胞密度逐漸下降。結論視網(wǎng)膜光感受器細胞密度在年齡和區(qū)域上均有一定的變化規(guī)律。在正常老齡化進程中，光感受器細胞密度的下降貫穿于整個視網(wǎng)膜之中。

斑馬魚；視網(wǎng)膜；光感受器細胞

斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞占所有視網(wǎng)膜細胞總數(shù)的70%左右，在一些以光感受器細胞退變?yōu)橹鞯囊暰W(wǎng)膜疾病研究上具有獨特優(yōu)勢〔1〕。光感受器細胞主要分為視桿細胞和視錐細胞〔2〕。視錐細胞依據(jù)它們對光譜的最大敏感度可以進一步分為四種類型，分別對紫外光(UV)及紅光、綠光、藍光(RGB) 敏感〔3〕。本文擬研究不同年齡野生型斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞密度的動態(tài)變化。

1　材料與方法

1.1動物飼養(yǎng)AB野生型斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)的恒溫魚房內進行培育飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1JB-4福爾根組織學檢查分別固定3、15、27個月野生型斑馬魚雙眼眼球于4%多聚甲醛溶液中，常溫過夜。將固定后的標本進行梯度酒精脫水，并將標本及JB-4混合液放置于包埋模具(JB-4包埋試劑盒，Polysciences公司)內。將包埋后的眼組織標本用超薄切片機(Thermo Electron公司)經(jīng)過前-后以及腹-背兩個方向進行切割。每個切片的厚度是3 μm。在常溫下將切片浸泡于3 N鹽酸中過夜，將染色后的切片在蒸餾水中浸泡10 min。在常溫下將切片在Schiff試劑(Santa Cruz公司)中浸泡2 h，用流水沖洗30 s，再在蒸餾水中浸泡5 min。經(jīng)過洗滌后的切片在常溫下進行干燥，中性樹膠封片。

1.2.2光感受器細胞觀察及計數(shù)在奧林巴斯BX60顯微鏡UplanApo 20×/0,80油鏡下觀察結果，所有圖像均在同一暴露時間下應用4.6版Spot軟件(Diagnostic Instruments公司)進行拍攝。將經(jīng)過眼球前-后及腹-背兩個方向切割并經(jīng)福爾根染色后拍攝的完整視網(wǎng)膜圖像分為周邊區(qū)、旁中央?yún)^(qū)及中央?yún)^(qū)。依據(jù)此分區(qū)方法將視網(wǎng)膜共分為九個區(qū)域進行細胞計數(shù)：前周邊區(qū)、前旁中央?yún)^(qū)、中央?yún)^(qū)、后旁中央?yún)^(qū)、后周邊區(qū)、腹周邊區(qū)、腹旁中央?yún)^(qū)、背旁中央?yún)^(qū)及背周邊區(qū)。

1.3統(tǒng)計學方法每個樣本選取平行于視網(wǎng)膜細胞層延伸200 μm長度范圍內的區(qū)域計數(shù)三類細胞視桿細胞、UV視錐細胞以及RGB視錐細胞。每個樣本選取經(jīng)過連續(xù)切割的三張切片，分別對視網(wǎng)膜的各個區(qū)域各類細胞進行計數(shù)后取它們的算數(shù)平均值進而獲得每個樣本的細胞密度。再計算所有相同年齡斑馬魚視網(wǎng)膜各個區(qū)域各類細胞密度的算數(shù)平均值，從而最終獲得各年齡斑馬魚視網(wǎng)膜不同區(qū)域不同種類細胞的細胞密度。應用SPSS19.0軟件進行配對t檢驗。

2　結　果

2.1視網(wǎng)膜光感受器細胞密度隨年齡增長逐漸下降隨斑馬魚年齡增長，在視網(wǎng)膜各個區(qū)域所有種類的光感受器細胞密度均逐漸下降。以中央?yún)^(qū)為例，27個月較3個月斑馬魚視網(wǎng)膜三類光感受器細胞密度均顯著下降(P<0.05)。其中，視桿細胞密度下降9%，UV視錐細胞密度下降30%，RGB視錐細胞密度下降34%。在視網(wǎng)膜其他8個區(qū)域，27個月較3個月斑馬魚視網(wǎng)膜三類光感受器細胞密度也均顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.2視網(wǎng)膜光感受器細胞密度的區(qū)域性變化以15個月斑馬魚為例，按照中央-旁中央-周邊方向分別在前部、后部、腹部及背部四個區(qū)域進行細胞密度比較。以背部區(qū)為例，旁中央?yún)^(qū)三類光感受器細胞密度比旁中央?yún)^(qū)增加51%～64%，旁中央?yún)^(qū)三類光感受器細胞密度比周邊區(qū)增加14%～19%。在其他三個區(qū)域內細胞密度也存在相似的變化趨勢。3個月和27個月斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞密度在四個區(qū)域存在相似的變化趨勢。視網(wǎng)膜光感受器細胞密度總體區(qū)域性變化趨勢：中央?yún)^(qū)細胞密度最大，從中央?yún)^(qū)到周邊區(qū)細胞密度逐漸下降。見表1，圖1。

表1　3、15、27個月斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞密度±s,個)

圖1　15個月視網(wǎng)膜光感受器細胞密度的區(qū)域性變化

3　討　論

野生型斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細胞密度在各個區(qū)域隨年齡增長的變化趨勢說明：在正常老齡化進程中，所有類型的視網(wǎng)膜光感受器細胞密度均逐漸下降，這種下降貫穿于整個視網(wǎng)膜之中。這種隨年齡增長細胞密度下降的變化趨勢考慮是由于野生型斑馬魚隨著眼球發(fā)育視網(wǎng)膜逐漸變長，視網(wǎng)膜延長使細胞分布變得稀疏，同樣區(qū)域內細胞密度減少。考慮到斑馬魚視網(wǎng)膜獨特的神經(jīng)再生特點〔4～6〕，細胞下降數(shù)目可能會更多。視網(wǎng)膜光感受器細胞的密度同時存在區(qū)域性變化規(guī)律。在生長早期，視網(wǎng)膜光感受器細胞發(fā)育從周邊部開始，逐漸向中央?yún)^(qū)及兩側延伸，最終形成特殊的正態(tài)分布規(guī)律：視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)細胞密度最大，從中央?yún)^(qū)到周邊區(qū)細胞密度逐漸下降。這種光感受器細胞密度在年齡和區(qū)域上變化規(guī)律的發(fā)現(xiàn)有助于進一步研究視網(wǎng)膜的發(fā)育機制。斑馬魚的視網(wǎng)膜光感受器細胞以視錐細胞為主〔7～9〕，是研究以光感受器細胞退變?yōu)橹饕∽儥C制的視網(wǎng)膜退行性疾病的極佳模式動物〔1〕。掌握正常視網(wǎng)膜光感受器細胞密度隨年齡增長的變化規(guī)律可以為研究視網(wǎng)膜退變提供必要的基礎數(shù)據(jù)。通過本文視網(wǎng)膜視錐細胞隨年齡增長逐漸死亡，特別是到晚期視錐細胞大量死亡的研究結果可以進一步揭示人類年齡相關性黃斑變性、Leber先天性黑矇以及視網(wǎng)膜色素變性的發(fā)病機制。

1Szamier RB,Berson EL.Retinal ultrastructure in advanced retinitis pigmentosa〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,1977;16(10):947-62.

2Nawrocki L,Bremiller R,Streisinger G,etal.Larval and adult visual pigments of the zebrafish,Brachydanio rerio〔J〕.Vision Res,1985;25(11):1569-76.

3Robinson J,Schmitt EA,Harosi FI,etal.Zebrafish ultraviolet visual pigment:absorption spectrum,sequence,and localization〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1993;90(13):6009-12.

4Fernald RD.Teleost vision:seeing while growing〔J〕.J Exp Zool Suppl,1990;5:167-80.

5Marcus RC,Delaney CL,Easter SS Jr.Neurogenesis in the visual system of embryonic and adult zebrafish(Danio rerio)off〔J〕.Vis Neurosci,1999;16(3):417-24.

6Otteson DC,D'Costa AR,Hitchcock PF.Putative stem cells and the lineage of rod photoreceptors in the mature retina of the goldfish〔J〕.Dev Biol,2001;232(1):62-76.

7Curcio CA,Sloan KR,Kalina RE,etal.Human photoreceptor topography〔J〕.J Comp Neurol,1990;292(4):497-523.

8Bilotta J,Saszik S,Sutherland SE.Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish〔J〕.Dev Dyn,2001;222(4):564-70.

9Doerre G,Malicki J.Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina〔J〕.Mech Dev,2002;110(1-2):125-38.

〔2016-01-22修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金資助項目(81400433);吉林大學白求恩計劃資助項目(2015306);吉林大學優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助項目(419080500588)

康治臣(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)、骨骼系統(tǒng)疾病康復及神經(jīng)電生理研究。

付金玲(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事退變性視網(wǎng)膜病變機制研究。

R774.1

A

1005-9202(2016)16-3893-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.010

1吉林大學第一醫(yī)院脊柱外科2吉林大學第二醫(yī)院康復科