朱亞芳

（河北中石油中心醫(yī)院，河北 廊坊）

0 引言

據(jù)資料顯示，癌癥已經(jīng)成為了威脅人類生命健康的主要疾病之一，其具有發(fā)病隱蔽、轉(zhuǎn)移性高、復(fù)發(fā)率高、腫瘤細(xì)胞耐藥強(qiáng)等特點(diǎn)，導(dǎo)致臨床治療困難[1-3]。為了有效的控制疾病的發(fā)展，提高患者的生活質(zhì)量與生存率，急需一種有效的抗腫瘤藥物。據(jù)資料顯示，新藤黃酸對不同腫瘤細(xì)胞的增殖具有有效的抑制作用，能明顯控制患者病情的發(fā)展，提高其生活質(zhì)量和生存率[4-8]。本研究就是為了分析觀察新藤黃酸對肺癌血管生成的影響以及初步的作用機(jī)制，具體結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：選用中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人肺腺癌細(xì)胞A549，以及上海源葉生物有限公司的新藤黃酸。

檢測材料：胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基，Matrigel，胰蛋白酶，DAPI，An-NexinV-FITC/PI雙 染 法 試 劑 盒，LY294002，Akt、β-actin抗體，PI3K、p-PI3K、p-Akt、VEGF，PI3K、Akt、β-actin引物，PTENsiRNA序列（上游 5’-GGCUAAGUGAAGAUGACAATT-3’和 下 游 5’-UUGU-CAUCUUCACUUAGCCTT-3’），Lipofectamine 2000TM。

儀器材料：生物安全柜、高壓滅菌鍋、高速立式冷凍離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 新藤黃酸對HUVEC血管成管的影響

選用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在使用前先放置4℃溫度下預(yù)冷，接著將液體狀態(tài)的Matrigel膠注入各孔，按照300μL/孔的規(guī)格，然后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。最后將HU-VEC接種于用Matrigel膠覆蓋的細(xì)胞培養(yǎng)板，按照8×104個(gè)/孔的規(guī)格，并依次加入不同濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（37℃，5%CO2）。通過倒置顯微鏡于培養(yǎng)18h后對其的管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)進(jìn)行觀察記錄[9-10]。

1.2.2 新藤黃酸對細(xì)胞凋亡率的影響

①將對數(shù)生長期的HUVEC接種于6孔板中，按照1×105個(gè)/孔的規(guī)格。先對其進(jìn)行孵育培養(yǎng)，然后將舊培養(yǎng)液換成含1，2，4μmol·L-1GNA的條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。接著采用不含EDTA-Na2的細(xì)胞消化液進(jìn)行消化離心處理，并收集處理后的細(xì)胞。②對收集到的細(xì)胞使用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液進(jìn)行沖洗（2遍，1800r·min-1離心5min）。然后加入400μL的PBS重懸細(xì)胞、5μL的AnnexinV-FITC，并使用吹打管吹打均勻，避光培養(yǎng)15min后，再加入5μL的PI進(jìn)行充分混合，避光培養(yǎng)5min后使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 新藤黃酸對蛋白表達(dá)的影響[11]

①將各組細(xì)胞消化收集后的細(xì)胞，使用PBS（4℃）進(jìn)行洗滌2次，然后加入PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液并置于冰上孵育10min，接著采用高速立式冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心分離（12000r·min-1）5min后收集上層澄清液于EP管中，最后加入LoadingBuffer后于100℃下煮10min，置于4℃下保存。②采用蛋白定量試劑盒和ECL試劑盒嚴(yán)格根據(jù)說明書對其進(jìn)行操作。

1.2.4 PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，新藤黃酸對PI3K，Akt基因的表達(dá)水平的影響

①在6孔板中接種細(xì)胞，按照1×106/孔的規(guī)格，然后加入不含抗生素的培養(yǎng)基1.8mL。從每孔中取出2μL的50μmol/LPTEN-siRNA儲液，并將其溶于Opti-MEMIReducedSerumMedium中進(jìn)行稀釋混合。②根據(jù)Lipofectamine2000TM5μL/孔、Op-ti-MEMI ReducedSerumMedium100μL/孔的規(guī)格進(jìn)行稀釋混合，并放置于常溫下保存5min。③將兩組進(jìn)行混合，并放置于常溫下保存20min，然后除去舊培養(yǎng)基并使用不含血清培養(yǎng)基洗滌2次，并給每孔換上新鮮培養(yǎng)基1.8mL后，加入轉(zhuǎn)染試劑，并于輕輕搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)6h。④采用流式細(xì)胞儀和biocaptMV軟件，嚴(yán)格參照說明書對轉(zhuǎn)染效率和mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 新藤黃酸對HUVEC血管成管的影響

倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，新藤黃酸能使得HUVEC細(xì)胞形態(tài)變成梭狀，并向凝膠基質(zhì)中延伸，呈現(xiàn)線性排列并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。并且由于濃度的不同，細(xì)胞成管數(shù)不同，隨著濃度的增加，細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)逐漸減少。

2.2 新藤黃酸對細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率在GNA的1、2和4μmol/L濃度下分別為（4.5±1.9）%，（9.2±2.4）%，（30.5±6.4）%，與空白對照組（0.21±0.02）%相比具有明顯差異（P＜0.05）。

2.3 新藤黃酸對蛋白表達(dá)的影響

HUVEC的p-PI3K，p-Akt蛋白表達(dá)量隨著GNA藥物濃度的增加而下降，但蛋白PI3K表達(dá)量基本不變。當(dāng)PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，結(jié)果顯示經(jīng)GNA作用后PI3K，AktmRNA基因的表達(dá)水平明顯高于空白對照組（P＜0.05）。

3 討論

藤黃（gamboge）為藤黃科植物藤黃Garcinia hanbaryi Hook.f.的樹干被割傷后流出的膠狀樹脂[12-14]。近20年來，對藤黃及其活性成分藤黃酸等做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)藤黃具有抗癌作用，并經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)證明其主要的有效成分是以藤黃酸（gambogic acid）為代表的橋環(huán)化合物，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區(qū)別，能選擇性地殺死癌細(xì)胞，而對正常的造血系統(tǒng)和白細(xì)胞沒有影響[15]。1984年呂歸寶從中藥藤黃中分離得到新藤黃酸，根據(jù)目前研究表明，新藤黃酸與藤黃酸相比具有作用強(qiáng)，毒性低、穩(wěn)定性好和抗癌譜廣等特點(diǎn)。

VEGF是目前所知最強(qiáng)的、直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成促進(jìn)因子。普遍認(rèn)為VEGF是腫瘤血管生成的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞上特異性的有絲分裂素，與其受體Flt-1和KDR/Flk-1選擇性位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，激活VEGF和其受體皆可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，刺激血管生成的全過程，增強(qiáng)微血管通透性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥藤黃中含有新藤黃酸對肺腺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制作用，能有效的誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡及抑制細(xì)胞自噬，并且還具有抑制血管生成的作用（抑制效果與劑量有關(guān)）和抑制p-PI3K，p-Akt蛋白的表達(dá)水平的作用。當(dāng)PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，能促進(jìn)PI3K，AktmRNA基因的表達(dá)與空白對照組相比（P＜0.05）。

綜上所述，新藤黃酸具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，能有效的阻斷腫瘤血管生成中的重要環(huán)節(jié)。其具有的抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管形成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。