楊嘉嘉 郭晶晶 張 宇 林禮務(wù)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是一種特殊的乳腺癌亞型，其好發(fā)年齡較年輕、組織學(xué)分級高、易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、進展快、預(yù)后差。TNBC因為雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)表達缺失不適宜內(nèi)分泌治療及以HER-2為靶點的治療，化療是其主要的內(nèi)科治療方法[1～3]。TNBC患者接受新輔助化療后病理完全緩解率較高，但易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，臨床上仍亟需新的治療方案[4,5]。由于TNBC中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)過度表達，表達率高達60%～70%，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與TNBC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，被認為是潛在的TNBC靶向治療的靶點之一[6，7]。西妥昔單抗是一種重組人和嵌合體鼠的EGFR單克隆抗體，能通過特異性結(jié)合于細胞外區(qū)域的EGFR而發(fā)揮作用。然而現(xiàn)有研究表明西妥昔單抗在TNBC的臨床應(yīng)用中療效有限，本研究擬聯(lián)合超聲靶向微泡破壞技術(shù)與西妥昔單抗進行抗TNBC裸鼠移植瘤的實驗研究，探討微泡破壞引起的空化效應(yīng)對西妥昔單抗抑制TNBC生長作用的影響[8，9]。

材料與方法

1.材料：(1)實驗動物與瘤株：40只5～6周齡SPF級BALB/c nu-nu雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，合格證號：2015000551166，體質(zhì)量16～20g，飼養(yǎng)在福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗動物室內(nèi)，實驗動物許可證號：SYXK(閩)2016-0006。人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由中國科學(xué)院上海細胞庫提供。動物實驗過程嚴格按照福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗指導(dǎo)原則進行。(2)主要試劑與儀器：西妥昔單抗購自德國Merck公司，Sono Vue購自瑞士Bracco Imaging B.V.公司，胰酶細胞消化液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，鹽酸利多卡因購自上海朝暉藥業(yè)有限公司，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；超聲波治療儀購自深圳圣祥高科技有限公司； Aplio 500超聲診斷儀購自日本Toshiba公司，配有PLT-805AT探頭，頻率9MHz。

2.動物模型的建立：MDA-MB-231細胞于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基、37℃及5%CO2飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后離心，以0.9%氯化鈉注射液調(diào)整細胞密度為1×107/ml，于每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.1毫升/只。

3.實驗動物模型分組及超聲介入治療：行二維超聲檢查觀察移植瘤生長情況，當移植瘤平均直徑達1cm時，將荷瘤裸鼠隨機分為4組，每組10只：超聲輻照微泡+西妥昔單抗組(A組)予西妥昔單抗混懸液(西妥昔單抗∶0.9%氯化鈉注射液為100mg∶50ml)以50ml/kg體質(zhì)量經(jīng)裸鼠尾靜脈緩慢注射，隨后超聲微泡造影劑Sono Vue以5ml/kg體質(zhì)量團注尾靜脈，超聲波治療儀設(shè)置頻率為850kHz、聲強0.75W/cm2的超聲波能量輻照腫瘤部位，輻照時間3min；西妥昔單抗組(B組)僅予西妥昔單抗混懸液50ml/kg體質(zhì)量尾靜脈緩慢注射；超聲輻照微泡組(C組)予0.9%氯化鈉注射液50ml/kg體質(zhì)量尾靜脈注射，隨后以A組相同方式注射Sono Vue及進行超聲輻照；對照組(D組)予尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液50ml/kg。每組每天給予上述治療措施1次，連續(xù)治療7天。

4.腫瘤體積測量：分別于首次治療前及末次治療后第1天，以Aplio 500超聲診斷儀(PLT-805AT探頭，頻率9MHz)進行二維超聲檢查，測量腫瘤的最大上下徑(L)、左右徑(W)、前后徑(H)，依據(jù)公式 V=πLWH/6計算腫瘤體積，取各組腫瘤體積均值進行比較。

5.超聲造影檢查：分別于首次治療前及末次治療后第1天行超聲造影檢查，檢查前以2%鹽酸利多卡因5μl/g體質(zhì)量腹腔麻醉裸鼠，Aplio 500超聲診斷儀(PLT-805AT探頭，頻率9MHz)啟動造影模式，機械指數(shù)為0.08，經(jīng)裸鼠尾靜脈團注Sono Vue 5ml/kg體質(zhì)量，隨后推注0.2ml 0.9%氯化鈉注射液沖管，同時選擇TIME及RAW STORE 選項，對造影圖像進行錄像，整個超聲造影過程最大限度固定手的位置，保證圖像穩(wěn)定。造影錄像經(jīng)超聲診斷儀自帶的Toshiba TCA軟件繪制時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)，分析各組腫瘤的造影峰值強度(peak intensity，PI)和曲線下面積(area under the curve，AUC)。

6.病理組織學(xué)檢查：超聲造影檢查結(jié)束后，處死裸鼠，取腫瘤組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理變化；應(yīng)用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒以BIOTIN 標記POD法染色組織切片，光學(xué)顯微鏡下觀察，細胞核染成棕色的為陽性細胞。每個切片隨機選擇5個高倍視野(×400)，每個視野分別計數(shù)200個細胞，共計1000個細胞，計算陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比即為凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。

結(jié) 果

1.腫瘤體積：治療前(接種腫瘤后第15天)超聲測量裸鼠移植瘤最大直徑均值為1.03±0.16cm，腫瘤呈類圓形或橢圓形；治療前各組移植瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。末次治療后第1天測量，各組腫瘤體積均較治療前有所增長，但A、B、C組腫瘤體積均低于D組(P<0.05)，其中A組腫瘤體積最小(P<0.05,表1)。

2.超聲造影定量指標：移植瘤富血供區(qū)域在超聲造影時呈增強表現(xiàn)，乏血供區(qū)域呈“充盈缺損”改變(圖1A)，TIC曲線呈單峰波形(圖1B)。治療前各組造影曲線PI值及AUC值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療后A組PI值低于其余各組(P<0.05)，而B、C、D組PI值組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后AUC值A(chǔ)組低于B、C、D組(P<0.05)，C組低于D組(P<0.05)，其余各組AUC值組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表1)。

組別體積(cm3)PI(×10-5AU)AUC(×10-5AU·s)治療前治療后治療前治療后治療前治療后AI(%)A組0.52±0.080.64±0.0851.30±8.6734.20±8.662705.53±418.111140.08±314.7044.04±8.36B組0.53±0.070.80±0.10?52.79±7.5849.41±8.45?2818.70±364.852299.10±356.45?38.27±6.69?C組0.51±0.090.89±0.09?#52.83±6.2345.93±9.36?2775.31±415.272023.37±354.98?32.46±5.89?#D組0.52±0.050.99±0.09?#△52.17±6.1451.28±7.27?2798.92±357.252682.63±444.99?△1.60±0.73?#△

圖1 超聲造影檢查A.裸鼠皮下TNBC移植瘤(箭頭所示)經(jīng)超聲輻照微泡聯(lián)合西妥昔單抗治療后，超聲造影顯示腫瘤內(nèi)局部呈“充盈缺損”改變；B.為A圖所示移植瘤的超聲造影TIC曲線，PI值為27.3(10-5AU)，AUC值為1236.1(10-5AU·s)

3.腫瘤組織HE染色光鏡檢查：A組裸鼠腫瘤組織大片狀壞死，壞死組織結(jié)構(gòu)不清，細胞輪廓消失(圖2A)；B組及C組腫瘤內(nèi)見相間分布的壞死組織(圖2B、C)；而D組腫瘤細胞生長良好，胞質(zhì)嗜酸性，核大深染(圖2D)。

4.各組裸鼠移植瘤治療后TUNEL檢測：A組腫瘤組織內(nèi)見大量棕色染色的凋亡細胞，呈彌漫片狀分布(圖3A)；B組腫瘤組織內(nèi)凋亡細胞呈斑片狀相間分布(圖3B)；C組凋亡細胞呈彌漫散在分布(圖3C)；D組腫瘤細胞生長良好，凋亡細胞鮮見(圖3D)。AI值比較顯示，A、B、C組AI值均高于D組(P<0.05)，其中A組AI值最高(P<0.05),B組次之(P<0.05)。

圖2 各組裸鼠移植瘤治療后的腫瘤組織HE染色(×200)A.超聲輻照微泡+西妥昔單抗組(A組)；B.西妥昔單抗組(B組)；C.超聲輻照微泡組(C組)；D.對照組(D組)

圖3 各組裸鼠移植瘤治療后的腫瘤組織TUNEL檢測(×400)A.超聲輻照微泡+西妥昔單抗組(A組)；B.西妥昔單抗組(B組)；C.超聲輻照微泡組(C組)；D.對照組(D組)

討 論

乳腺癌的內(nèi)科治療包括化療、內(nèi)分泌治療和靶向藥物治療。靶向治療特異性較強，毒性不良反應(yīng)相對較小，是近年來TNBC研究的熱點。本研究所使用的西妥昔單抗是針對EGFR為靶點的單克隆抗體，可競爭性地結(jié)合EGFR的胞外部分，從而引起腫瘤細胞周期阻滯和凋亡,抑制腫瘤生長、血管形成及侵襲轉(zhuǎn)移，因此被認為是具有潛力的TNBC靶向治療藥物。然而現(xiàn)有的臨床研究顯示，西妥昔單抗在TNBC治療的臨床應(yīng)用中療效尚不明確[9，10]。Williams等[11]采用西妥昔單抗單藥治療TNBC，發(fā)現(xiàn)治療前后腫瘤體積未發(fā)生明顯變化。Garey等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對TNBC患者分別采用西妥昔單抗單藥及聯(lián)合卡鉑治療，其有效率分別為6%和16%。Baselga等[13]聯(lián)合應(yīng)用西妥昔單抗和順鉑治療轉(zhuǎn)移性TNBC，總有效率從10%提高到20%，無進展生存期從1.5個月提高到3.7個月，總生存期從9.4個月提高到12.9個月?？傮w而言，西妥昔單抗聯(lián)合化療藥物治療TNBC的效果優(yōu)于單藥治療，但是化療藥物的使用可能引發(fā)較為明顯的不良反應(yīng)[12，14]。

超聲靶向破壞微泡技術(shù)通過注射一定劑量的微泡造影劑，以一定強度的超聲輻照腫瘤局部，使微泡發(fā)生破裂，產(chǎn)生空化效應(yīng)，一方面可能引起微血管壁結(jié)構(gòu)崩解，局部血腫及血栓形成，從而在一定程度上阻斷腫瘤血液供應(yīng)，另一方面能使微血管或細胞的通透性升高，促進藥物滲透，該技術(shù)具有定點、微創(chuàng)、全身不良反應(yīng)小的優(yōu)勢[15，16]。目前已有研究表明超聲破壞微泡引起的空化效應(yīng)能提高藥物的療效[17～20]。Luo等[19]采用超聲輻照阿霉素載藥微泡，能取得較好的抑制腫瘤血管生成及促進腫瘤細胞凋亡的效果。余堰瀾等[20]采用超聲輻照微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)聯(lián)合恩度治療乳腺癌可顯著減少腫瘤血液灌注、抑制腫瘤生長。

本研究采用超聲輻照微泡聯(lián)合西妥昔單抗、及單用西妥昔單抗或超聲輻照微泡對裸鼠TNBC移植瘤進行治療后，腫瘤體積均低于對照組(P<0.05)，說明3種治療方法均具有抑制TNBC生長的作用，其中聯(lián)合治療組的腫瘤體積低于其余各組(P<0.05)，腫瘤生長受抑制程度最明顯。這可能由于超聲輻照微泡產(chǎn)生空化效應(yīng)，導(dǎo)致微血管壁通透性增加，甚至引起微血管的損毀，從而促進西妥昔單抗自血液循環(huán)大量滲透入腫瘤間質(zhì)，提高腫瘤局部的藥物濃度，增強藥物抗腫瘤作用；同時超聲空化效應(yīng)介導(dǎo)的血流阻斷可能發(fā)揮一定的抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)，使聯(lián)合治療的療效優(yōu)于單一療法。超聲造影定量指標PI及AUC值反映了腫瘤微循環(huán)灌注水平，本研究中C組AUC值低于D組(P<0.05)，說明超聲輻照微泡可引起腫瘤血液灌注減少，這與以往研究結(jié)果相同[20]。B組AUC值與D組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這提示單用西妥昔單抗對TNBC腫瘤的血液灌注影響不大,而A組的PI及AUC值均低于其余各組(P<0.05)，說明超聲輻照微泡聯(lián)合西妥昔單抗的方法較其他療法能更顯著地減少腫瘤血液灌注。腫瘤組織由于缺血、缺氧而發(fā)生壞死，這可能是A組移植瘤中壞死組織范圍較大的原因之一。治療后的TUNEL檢測于A、B、C組中均觀察到明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，說明3種治療方法均能誘導(dǎo)TNBC細胞凋亡，其中A組AI值最高(P<0.05)，提示超聲空化效應(yīng)對西妥昔單抗誘導(dǎo)TNBC細胞凋亡具有協(xié)同作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，超聲空化效應(yīng)能夠增強西妥昔單抗對TNBC的抑制作用，超聲輻照微泡聯(lián)合西妥昔單抗治療裸鼠TNBC移植瘤較單一療法能顯著減少腫瘤血液灌注，促進細胞凋亡及組織壞死，從而抑制腫瘤生長。本研究所討論的治療方法較為便捷、易于實現(xiàn)，具有一定的臨床應(yīng)用潛力，值得深入探討。