張旭紅，陳 杰

(1.烏蘭察布市中心醫(yī)院產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

近年來，不孕不育患者比例呈逐年增高趨勢[1]。隨著國家生育政策的開放，較多家庭選擇生育二胎，有生育需求的高齡產(chǎn)婦比例大幅增加。為此，輔助生殖技術(shù)飛速發(fā)展，也推動了卵巢組織體外保存技術(shù)的發(fā)展，但是卵巢組織在體外保存過程中，大量卵泡丟失、死亡，或者出現(xiàn)空卵泡等卵巢早衰現(xiàn)象，為卵巢組織體外保存技術(shù)帶來了新的挑戰(zhàn)。促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)能夠促進(jìn)卵泡的發(fā)育成熟[2]，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，同時促進(jìn)卵泡周圍顆粒細(xì)胞VEGF及縫隙連接蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成、卵泡發(fā)育成熟[3]。研究顯示，適當(dāng)劑量的FSH體外短暫干預(yù)新鮮卵巢組織可有效提高凍融卵巢卵泡的存活率，并縮短凍融卵巢組織移植后血流重建時間，其機制是上調(diào)了能加速血管新生以及血管重建的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)[4]。血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)是VEGF調(diào)控血管新生的主要酪氨酸激酶功能受體[5]，主要功能是在各種病理、生理情況下介導(dǎo)新生血管的形成[6]，同時其也是血管新生和有絲分裂過程主要的VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。因此，本研究擬通過小鼠卵巢組織體外培養(yǎng)過程中添加FSH的干預(yù)方式探究其在卵巢組織體外培養(yǎng)過程中是否可有效保護(hù)卵巢組織，以期為提高輔助生殖技術(shù)成功率、促進(jìn)卵巢組織體外培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 以9只4周齡(處于青春期)C57BL/6J(合格證號:000664)雌性小鼠為研究對象，每日光照12 h，環(huán)境溫度保持在22～24 ℃，自由飲水取食。

1.1.2 主要試劑 FSH：注射用重組人卵泡刺激素(果納芬)購自瑞士默克雪蘭諾制藥廠；白蛋白：人血清白蛋白購自Sigma；一抗VEGF及VEGFR-2(兔抗小鼠多克隆抗體)購自Abcam；熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體的配制 基液按DMEM∶F12(1∶1)配制。培養(yǎng)液含12%人血清白蛋白，添加FSH濃度為0.3 IU/mL。

1.2.2 卵巢組織的獲取 頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精消毒，在背部腎區(qū)切開皮膚及筋膜取出卵巢組織。

1.2.3 實驗分組 將9只小鼠卵巢組織剝?nèi)ネ饽?，隨機分為3組，每組6枚。新鮮對照組(CG組)：提取卵巢組織后直接固定或提取總RNA。體外培養(yǎng)對照組(VCG組)：提取卵巢組織后將其放入培養(yǎng)液于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，之后投入液氮凍存24 h，解凍過程為凍存組織依次浸入梯度遞減的解凍液，組織解凍完成再進(jìn)行固定或提取總RNA，凍存全程不添加FSH干預(yù)。FSH干預(yù)體外培養(yǎng)組(IG-FSH組)：體外培養(yǎng)過程添加0.3 IU/mL FSH，進(jìn)行保護(hù)性干預(yù)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)實驗觀察VEGF、VEGFR-2表達(dá) 將卵巢組織以4%多聚甲醛固定24 h，用多聚賴氨酸處理后的載玻片制作石蠟切片(切片厚度5 μm)。將切片脫水，PBS液沖洗3次，每次5 min，檸檬酸鹽緩沖液微波加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)。后續(xù)3% H2O237 ℃避光孵育10 min，山羊血清(與二抗同源)37 ℃封閉30 min。加一抗(VEGF稀釋為1∶200，VEGFR-2稀釋為1∶100)4 ℃過夜。第2天，切片復(fù)溫30 min，PBS液沖洗3次，每次5 min，反應(yīng)增強液37 ℃孵育30 min，二抗37 ℃孵育60 min，DAB(1∶50)顯色，鏡下觀察，PBS終止反應(yīng)，封片。顯微鏡下觀察VEGF及VEGFR-2陽性表達(dá)情況。采用DP Ctroller 3.1.1.267及Image Pro Plus 6.0軟件拍照并按陽性表達(dá)的熱區(qū)檢測累積光密度值(IOD值)。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá) 引物由上海生物工程有限公司合成，VEGF上游引物：5′-GTAACGATGAAGCCCTGGAGT-3′，下游引物：5′-TGTTCTGTCTTTCTTTGGTCTGC-3′；VEGFR-2上游引物：5′-ACTGTCATCCTTACCAATCCCA-3′，下游引物：5′-ATCTGGGGTGGGACATACAC-3′。采用TRIZOL法提取小鼠總RNA：將玻璃化凍融后的小鼠卵巢組織迅速放入預(yù)冷的勻漿器中研磨，再轉(zhuǎn)入無RNA酶的1.5 mL EP管中靜置5 min；加入200 μL氯仿震蕩15 s后于室溫靜置2 min，于4 ℃以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min；取上層水相，移至另1根1.5 mL EP管中；加入500 mL異丙醇，顛倒混勻，再于4 ℃以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min；晾干，加入1 mL冰預(yù)冷的75%乙醇充分混勻洗滌，再于4 ℃以7 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min；晾干，溶于高壓后的DEPC水，-80 ℃保存。檢測A260:A280的比值，確定RNA的純度。逆轉(zhuǎn)錄cDNA單鏈合成：加入2 μL TotalRNA、1 μL Anchored Oligo(dT) 18 Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript RT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover、5 μL RNase-free Water、20 μL Total輕輕混勻，于4 ℃以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min；將樣品置于PCR擴增儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃再循環(huán)。經(jīng)PCR設(shè)定溫度梯度，確定退火溫度。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃降溫10 min。上機進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，免疫組織化學(xué)技術(shù)及實時熒光定量PCR檢測結(jié)果均采用單因素方差分析檢驗，按α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FSH干預(yù)對VEGF及VEGFR-2蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IG-FSH組中VEGF及VEGFR-2蛋白表達(dá)量均高于CG組和VCG組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 實時熒光定量PCR檢測FSH干預(yù)后VEGF及VEGFR-2 mRNA表達(dá)

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：IG-FSH組和CG組VEGF mRNA表達(dá)量顯著高于VCG組(P<0.05)，但I(xiàn)G-FSH組和CG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2a。IG-FSH組VEGFR-2 mRNA表達(dá)量顯著高于CG組及VCG組(P<0.05)，CG組與VCG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2b。

a：VEGF免疫組織化學(xué)結(jié)果及定量分析；b：VEGFR-2免疫組織化學(xué)結(jié)果及定量分析 ★：原始卵泡；■：初級卵泡；▲：次級卵泡；*：與CG組比較，P<0.05；#：與VCG組比較，P<0.05圖1 FSH干預(yù)對體外保存卵巢組織VEGF及VEGFR-2蛋白表達(dá)的影響

a：VEGF;b:VEGFR-2 *：與VCG組比較，P<0.05；#：與CG組比較,P<0.05圖2 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討論

VEGF作為高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等重要作用[7]。而小鼠卵巢組織體外培養(yǎng)過程中血管的通透性以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移直接關(guān)系到體外保存過程中卵泡的存活數(shù)量及質(zhì)量[8]。VEGF在發(fā)揮促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用時，主要由內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-2(即VEGF受體)介導(dǎo)，VEGF與VEGFR-2結(jié)合后引起自身及相關(guān)蛋白的磷酸化[9-10]，從而啟動細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及信息傳遞，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，對維持卵巢組織體外培養(yǎng)過程中卵泡的正常生長發(fā)育有積極作用[11]。FSH作為輔助生殖技術(shù)中應(yīng)用廣泛的藥物之一，可對生殖細(xì)胞的發(fā)育成熟以及卵巢組織的內(nèi)分泌功能發(fā)揮積極作用[12]。

本研究免疫組化實驗表明，在卵巢組織體外培養(yǎng)過程中添加FSH進(jìn)行保護(hù)性干預(yù)可有效促進(jìn)VEGF及VEGFR-2蛋白的表達(dá)，效果顯著優(yōu)于CG組和VCG組。FSH在卵泡存活過程中發(fā)揮著重要作用,而VEGF及其受體VEGFR-2在FSH的促進(jìn)作用下有效結(jié)合，直接影響了卵巢間質(zhì)細(xì)胞的血管重建與再生，為體外培養(yǎng)過程中卵泡的存活提供了先決條件[13]。本研究實時熒光定量PCR檢測結(jié)果也證實，卵巢組織在體外培養(yǎng)過程中經(jīng)添加FSH干預(yù)性保護(hù)作用后，增加了VEGF及VEGFR-2 mRNA的表達(dá)，證明VEGF及VEGFR-2具有激素依賴性[14]，且在FSH的刺激作用下更有利于VEGF與其受體VEGFR-2結(jié)合充分發(fā)揮作用。據(jù)報道，F(xiàn)SH的干預(yù)是促進(jìn)VEGF及VEGFR-2表達(dá)的重要因素，且VEGF及其受體VEGFR-2能夠使卵泡數(shù)量成倍增加，本實驗證實了FSH在卵巢組織體外培養(yǎng)過程中起到了增加VEGF、VEGFR-2表達(dá)及促進(jìn)兩者結(jié)合的雙重作用，在卵巢組織玻璃化凍存過程中有效保護(hù)了卵巢卵泡的功能，為后期體外受精打下堅實基礎(chǔ)[15-16]。

綜上所述，小鼠卵巢組織體外培養(yǎng)過程中添加FSH進(jìn)行干預(yù)性保護(hù)，可有效促進(jìn)VEGF及VEGFR-2的表達(dá)，保證體外培養(yǎng)過程中的卵泡數(shù)量，減少卵泡損失，為輔助生殖技術(shù)的發(fā)展提供了實驗室研究證據(jù)。