張蕊 耿佳 王雪梅

摘要：目的? 研究不同應(yīng)激條件下的內(nèi)皮細胞（HUVECs）損傷模型中l(wèi)ncRNAs 的表達變化。方法? 將HUVECs分為正常對照組、H2O2干預(yù)組、LPS誘導(dǎo)組及ox-LDL干預(yù)組，正常對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)，H2O2干預(yù)組采用200 μmol/L 濃度的H2O2孵育12 h，LPS誘導(dǎo)組采用100 ng/ml LPS誘導(dǎo)6 h，ox-LDL干預(yù)組使用濃度為50 μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷48 h。建立模型后分別檢測心梗相關(guān)lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL在臍靜脈內(nèi)皮細胞中的mRNA表達;實時熒光定量法測定HUVECs中l(wèi)ncRNAs的表達，以及炎性因子VCAM-1、MCP-1和抗炎因子eNOS、IL-10、Arginine的mRNA表達;ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中促炎因子及抗炎因子的表達。結(jié)果? 與對照組相比，ox-LDL干預(yù)組lncRNA H19、MAIT、ANRIL的表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;炎性因子MCP-1和VCAM-1的mRNA表達水平均上調(diào)（P<0.05），eNOS的mRNA表達下調(diào)（P<0.05），細胞上清液中的MCP-1、VCAM-1的表達增加（P<0.05）。ox-LDL干預(yù)組的HUVECs細胞上清液中的eNOS活性低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? lncRNA H19、MIAT、MALAT1、ANRIL參與調(diào)控了內(nèi)皮細胞的脂質(zhì)代謝。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA;動脈粥樣硬化;人臍靜脈內(nèi)皮細胞;氧化型低密度脂蛋白

中圖分類號：R541.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.22.022

文章編號：1006-1959（2020）22-0071-05

Study on the Expression Regulation of Long Non-coding RNA in Endothelial Cell Injury Model

ZHANG Rui1，GENG Jia1，WANG Xue-mei1，2

（1.Teaching and Research Office of Hygiene，Department of Public Health，Xi'an Medical University，Xi'an 710021，Shaanxi，China;

2.the Key Laboratory of Animal Disease Model Research，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，

Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Abstract：Objective? To study the expression changes of lncRNAs in endothelial cell （HUVECs） injury models under different stress conditions. Methods? HUVECs were divided into normal control group， H2O2 intervention group， LPS induction group and ox-LDL intervention group. Normal control group cells were cultured routinely. The H2O2 intervention group was incubated with 200 μmol/L H2O2 for 12 h， and the LPS induction group was 100 ng/ml LPS was induced for 6 h， and the ox-LDL intervention group used a culture medium with a concentration of 50 μg/ml ox-LDL to induce endothelial cell damage for 48 h. After the model was established， the mRNA expression of myocardial infarction-related lncRNA H19， MAIT， MALAT1， and ANRIL in umbilical vein endothelial cells were detected; real-time fluorescence quantitative method was used to determine the expression of lncRNAs in HUVECs， as well as the inflammatory factors VCAM-1， MCP-1 And anti-inflammatory factors eNOS， IL-10， Arginine mRNA expression; ELISA method to detect the expression of pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors in the culture supernatant. Results? Compared with the control group， the expressions of lncRNA H19， MAIT and ANRIL in the ox-LDL intervention group were all up-regulated，the difference was statistically significant （P<0.05）; the mRNA expression levels of inflammatory factors MCP-1 and VCAM-1 were both up-regulated （P<0.05）， eNOS mRNA expression was down-regulated（P<0.05）， and the expression of MCP-1 and VCAM-1 in the cell supernatant increased（P<0.05）. The eNOS activity in the HUVECs cell supernatant of the ox-LDL intervention group was lower than that of the blank control group，the difference was significant （P<0.05）.Conclusion? lncRNA H19， MIAT， MALAT1， ANRIL participate in the regulation of lipid metabolism of endothelial cells.

Key words：Long non-coding RNA;Atherosclerosis;Human umbilical vein endothelial cells;Oxidized low-density lipoprotein

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是造成眾多心腦血管疾病（冠心病、腦梗死、外周血管疾病等）共同的病理基礎(chǔ)，是心血管疾病和死亡的重要原因，嚴重危害人類健康[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示[2]，衰老、吸煙、飲酒、高血壓、高血糖、高血脂是動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵危險因素。此外，動脈粥樣硬化的發(fā)病還具有家族易感基因遺傳傾向。隨著我國居民生活水平大幅度提高，飲食偏向高脂高糖，高能量導(dǎo)致人體代謝環(huán)境的整體改變，代謝應(yīng)激使得代謝性疾病的發(fā)生率大幅度增加，動脈粥樣硬化也呈上升趨勢[3]。探索一種新的有效防治AS的方法和作用靶點、延緩或阻止AS的發(fā)生與發(fā)展、降低其發(fā)病率和死亡率是醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。生命活動的調(diào)控是一個復(fù)雜又精細的網(wǎng)絡(luò)，分別從不同層面調(diào)控著疾病的發(fā)生和發(fā)展，如蛋白質(zhì)水平、基因水平、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。LncRNA由于本身特殊和復(fù)雜的調(diào)控機制，有時可以和蛋白質(zhì)互作調(diào)控功能，有時又通過表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，或者直接進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[4，5]。LncRNA的表達水平能更好地反映疾病狀態(tài)，其表達狀態(tài)可被用于某些疾病的精細分期或分類[6]。大量研究證明，lncRNA H19、MIAT、ANRIL和MALAT1與冠心病、肥胖、糖尿病、心梗密切相關(guān)，其有望成為急性心梗新的生物標志物和臨床治療的新靶點[7]。為此，本研究分別應(yīng)用H2O2、LPS、ox-LDL處理臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），建立動脈粥樣硬化相關(guān)的內(nèi)皮損傷細胞模型，檢測與動脈粥樣硬化相關(guān)的lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL在臍靜脈內(nèi)皮細胞中的表達及其不同的誘導(dǎo)應(yīng)激條件下的表達和調(diào)控機制，期望能夠為動脈粥樣硬化相關(guān)慢性疾病的發(fā)病機制提供新的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑? 細胞培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿（美國Corning）、HUVECs（中國上海細胞庫）、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone）、胎牛血清（美國Gibco）、胰蛋白酶（美國ScienCell）、青霉素/鏈霉素（美國HyClone）、二甲基亞砜（美國Invitrogen）、H2O2、LPS（美國Sigma）、ox-LDL（中國廣州Yiyuan Biotechnologies）、eNOS檢測試劑盒（中國武漢cusabio）、MCP-1因子的ELISA試劑盒、VCAM-1因子的ELISA試劑盒（中國武漢博士德生物工程有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（thermo生物公司）、實時熒光定量試劑盒（life公司）、lncRNA和mRNA引物（上海生工）。

1.2實驗分組? 采用隨機對照細胞模型實驗。HUVECs培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，并添加青霉素/鏈霉素100 U/ml。實驗中的HUVECs在第3～5代。將融合90%的HUVECs消化后計數(shù)，以5×104個/ml的密度接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，各實驗組均設(shè)3個復(fù)孔。內(nèi)皮細胞體外損傷模型的建立：①實驗分組：第一組為正常對照組，細胞常規(guī)培養(yǎng);第二組H2O2干預(yù)組，選用200 μmol/L 濃度的H2O2，孵育12 h;第三組為LPS誘導(dǎo)組，100 ng/ml LPS，誘導(dǎo)6 h;第四組為為ox-LDL干預(yù)組，添加ox-LDL到培養(yǎng)液中，使得終濃度為50 μg/ml，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷48 h。

1.3方法? 實時熒光定量法測定HUVECs中 lncRNA和炎性因子，氧化應(yīng)激指標，脂質(zhì)代謝相關(guān)分子的mRNA表達：實驗處理后，收集細胞上清液，將培養(yǎng)皿的細胞層用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗，棄去沖洗液，加入細胞裂解液，提取細胞的總RNA，按照1 μg總量的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行實時熒光光定量檢測。2-△△Ct法計算檢測相關(guān)因子的表達，引物序列見表1。ELISA法檢測HUVECs細胞上清液中的促炎因子和抗炎因子：細胞培養(yǎng)48 h后收集上清液，根據(jù)說明書測定VCAM-1、MCP-1的濃度，eNOS的活性。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析? 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），方差齊性以Levene's檢驗，當(dāng)方差齊時，選用LSD-t檢驗，當(dāng)方差不齊時，選用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同損傷模型中l(wèi)ncRNAs分子的表達比較? ox-LDL干預(yù)組lncRNA - H19、MAIT、ANRIL的表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;MALAT1表達高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1A。H2O2干預(yù)組lncRNA H19的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意（P<0.05），MAIT和ANRIL表達低于對照組，MALAT1表達高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1B。LPS誘導(dǎo)組lncRNA H19、MAIT、ANRIL的表達均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），MALAT1表達低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1C。

2.2 Ox-LDL誘導(dǎo)損傷模型中HUVECs細胞炎性因子的表達比較? Ox-LDL干預(yù)組的炎癥因子MCP-1和VCAM-1 mRNA表達均高于對照組，eNOS表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Ox-LDL干預(yù)組IL-10和Arginine表達低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

2.3 Ox-LDL誘導(dǎo)損傷模型中HUVECs上清液中的促炎因子表達比較? ox-LDL組細胞上清液中MCP-1、VCAM-1的表達高于對照組，eNOS表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

3討論

本研究主要檢測了氧化應(yīng)激、炎癥和高脂應(yīng)激三種誘導(dǎo)損傷模型中l(wèi)ncRNAs分子的表達，通過比較lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL的表達，發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷模型中l(wèi)ncRNA H19、MAIT、ANRIL的表達升高，在高脂應(yīng)激引起動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生機制中發(fā)揮作用，同時伴隨著炎癥的損傷加劇。

動脈粥樣硬化發(fā)生的重要始動因素是血管內(nèi)皮細胞的損傷，是一個長期動態(tài)累積的過程。對于AS發(fā)病機制的假說主要包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說（脂源性學(xué)說）、炎癥學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、血小板聚集和血栓形成學(xué)說等。脂質(zhì)浸潤學(xué)說認為血脂增高會引起脂質(zhì)滲入到血管壁，轉(zhuǎn)變成脂質(zhì)斑塊沉積。炎癥學(xué)說認為動脈粥樣硬化是一種以慢性炎癥反應(yīng)為特征的炎癥性疾病，其病理進程包含炎性巨噬細胞的表型增多，血管壁表層內(nèi)皮細胞的損傷，炎癥因子分泌增加，巨噬細胞吞噬脂質(zhì)形成壞死核心，平滑肌細胞增殖遷移，最終刺激血管壁纖維增生及斑塊形成。氧化應(yīng)激學(xué)說認為，機體的氧化還原是一個動態(tài)的平衡過程，當(dāng)機體受到外界刺激，細胞能量代謝紊亂，能量供應(yīng)器線粒體發(fā)生過度分裂，抑制細胞呼吸鏈的活性，引起細胞內(nèi)的活性氧（ROS）生成增加，ATP合成減少，膜電位ΔΨm降低，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴的血管舒張功能下降[8]。常見外源性應(yīng)激的刺激因子是：脂多糖、炎癥介質(zhì)、自由基、高糖等[9]。本研究模擬動脈粥樣硬化三大機制和條件，分別造成氧化應(yīng)激、炎癥、高脂誘導(dǎo)三種模型。第1種是H2O2刺激模擬氧化應(yīng)激的內(nèi)皮細胞損傷模型，H2O2能夠直接氧化細胞膜上的脂質(zhì)及蛋白，自由進入細胞內(nèi)，同細胞內(nèi)鐵離子反應(yīng)生成活性更強的自由基，導(dǎo)致一系列過氧化反應(yīng)[10];第2種是LPS刺激模擬經(jīng)典的炎癥損傷模型，LPS內(nèi)的類脂A和重要群特異性多糖O抗原是引起炎癥反應(yīng)、休克的重要介質(zhì)[11];第3種是ox-LDL刺激的高脂損傷模型，ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷，分泌炎癥因子，單核細胞趨化因子，促進單核細胞浸潤進入血管壁，分化成巨噬細胞，進而吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細胞。促進M1型巨噬細胞的表型，降低M2型巨噬細胞的表型，加劇炎癥反應(yīng) [13]。同時，ox-LDL會促進活性氧的生成，降低線粒體呼吸鏈的功能，促進細胞凋亡，減弱巨噬細胞的胞葬作用，加快脂質(zhì)核心的形成[14]。在本次研究中，通過測定lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL的表達，表明在不同病理模型都存在著lncRNA不同的表達譜。即lncRNA 的表達時向與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，但其相關(guān)表達機制相關(guān)研究還處于初始階段。

MCP-1、VCAM-1具有廣泛生物學(xué)活性，且與內(nèi)皮細胞炎癥損傷呈正相關(guān)關(guān)系。MCP-1是單核細胞趨化因子，由內(nèi)皮細胞分泌，通過募集血液中的單核細胞滲透進入血管壁，形成巨噬細胞發(fā)揮吞噬作用。VCAM-1能夠促進內(nèi)皮細胞對單核細胞的粘附，使單核細胞牢固粘附在管壁上，在巨噬細胞吞噬脂質(zhì)的過程中起到關(guān)鍵作用[15]。NO可促進血管的舒張，eNOS活性代表著血管NO合成的速率，eNOS是一種正向的活性調(diào)節(jié)酶[16]。本次實驗結(jié)果顯示，ox-LDL組細胞上清液中MCP-1、VCAM-1的表達升高，eNOS活性降低，因此可以認為在高脂應(yīng)激環(huán)境下，炎性因子的表達增高，使得心血管相關(guān)lncRNA表達，從而加劇動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

LncRNA在不同層次調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達機制已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點[17]。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）位于人染色體11q13，是第一個與肺癌疾病相關(guān)聯(lián)的長鏈非編碼RNA，研究顯示，MALAT1參與了壓力負荷小鼠的心臟重塑[18]。印記基因lncRNA H19位于人類11號染色體，參與心肌的纖維化，調(diào)控心肌肥厚的形成[19]，lncRNA H19的多態(tài)性與中國漢族人群冠心病的風(fēng)險和嚴重程度相關(guān)。有研究表明LncRNA H19通過調(diào)控mir-675的表達，間接下調(diào)胰島素樣生長因子-1受體，抑制妊娠期胎盤生長，參與糖尿病的病理發(fā)展[20]。INK4基因座中反義非編碼RNA（ANRIL）是9p染色體上的LNK4基因座的反義lncRNA，其位于冠心病易感區(qū)域，粥樣斑塊中ANRIL的表達能夠促進VSMC增殖和動脈粥樣斑塊形成[21]。心肌梗死相關(guān)lncRNA MIAT位于人類22號染色體上，是急性心梗的敏感位點，其高表達與AMI的發(fā)生呈正相關(guān)。研究報道急性心肌梗死患者外周血的lncRNA基因芯片測定結(jié)果，與正常組比較，表達譜有顯著性差異，MIAT和MALAT1 與心功能呈負相關(guān)。敲低MIAT的表達，減緩了糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷進程。即通過敲除MIAT基因，從而減少糖尿病誘導(dǎo)的促炎因子的釋放，達到減輕血管滲漏和視網(wǎng)膜血管的損傷的目的[22]。

總之，目前對于lncRNA的研究還處于初級階段，對于其具體導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展尚不明確，且明確功能的相關(guān)lncRNA數(shù)目并不多。隨著研究技術(shù)的提高，對于RNA水平的研究也越來越先進，以后會發(fā)現(xiàn)更多相關(guān)并具有一定功能的lncRNA，更深入研究其相關(guān)機制，為動脈粥樣硬化相關(guān)患者的防治提供新的診斷依據(jù)和診療措施。

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收稿日期：2020-06-30;修回日期：2020-08-01

編輯/成森

基金項目：1.國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目（編號：81760083）;2.西安醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：省級;校級<121519049>）;3.陜西省教育廳重點實驗室項目（編號：20JS137）

作者簡介：張蕊（1997.12-），女，陜西洛川縣人，本科

通迅作者：王雪梅（1983.2-），女，新疆庫爾勒人，博士，副教授，主要從事心血管疾病的基礎(chǔ)和臨床研究