周湘媛 曹斯瓊 孫冬梅 魏梅 潘禮業(yè) 陳向東 鄧淙友 李振雨

摘要：目的?采用高效液相色譜法，建立仙鶴草藥材的特征圖譜和含量測定方法，為仙鶴草藥材的質(zhì)量控制提供參考。方法?特征圖譜采用XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色譜柱;以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測波長為320nm，柱溫為30℃，并進(jìn)行相似度評價(jià)、聚類分析及主成分分析。采用XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色譜柱;以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，等度洗脫，檢測波長為254nm，柱溫30℃，測定仙鶴草藥材中槲皮苷的含量。結(jié)果?仙鶴草藥材特征圖譜有7個(gè)特征峰，除樣品S20（河南產(chǎn)區(qū)）之外，不同產(chǎn)區(qū)的仙鶴草藥材相似度均大于0.95;聚類分析將不同產(chǎn)地的仙鶴草藥材分為3類，主成分分析顯示，特征峰1、3、4和6是造成批次間差異的關(guān)鍵色譜峰;不同產(chǎn)地仙鶴草藥材中槲皮苷含量范圍為0.09%～0.22%，產(chǎn)地差異性較小。結(jié)論?所建立的HPLC特征圖譜和含量測定方法可用于仙鶴草藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：仙鶴草;HPLC;特征圖譜;槲皮苷;質(zhì)量控制

中圖分類號：R285.5?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）11-0056-07

【Abstract】Objective： To establish a characteristic map and content determination method of Agrimonia pilosa by HPLC and to provide reference for the quality control of Agrimonia pilosa. Methods： XSelect HSS T3 （4.6×250mm， 5μm） chromatographic column was used for the characteristic map. Acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution was as mobile phase， with gradient elution， 1.0mL/min flow rate， at 320nm detection wavelength and 30℃ of column temperature to carry out similarity evaluation， cluster analysis and principal component analysis. XSelect HSS T3 （4.6×250mm， 5μm） chromatographic column was used and acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution as mobile phase， with socratic elution， at 254nm detection wavelength and 30℃ of column temperature to determine the content of quercetin in Agrimonia pilosa. Results： The characteristic map of Agrimonia pilosa has 7 characteristic peaks. Except for sample S20 （Henan production area）， the similarity of Agrimonia pilosa in different production areas was greater than 0.95. Agrimonia pilosa from different producing areas was divided into 3 kinds by cluster analysis. The principal component analysis showed that characteristic peaks 1， 3， 4 and 6 were the key chromatographic peaks that cause differences between batches. The content of quercetin in Agrimonia pilosa of different origins ranged from 0.09% to 0.22%， and the difference in origin was small. Conclusion： The established HPLC characteristic map and content determination method can be used for the quality control of Agrimonia pilosa.

【Key words】Agrimonia pilosa， HPLC， characteristic map， quercetin， quality control.

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，具有收斂止血，截瘧，止痢，解毒，補(bǔ)虛的功效[1]，臨床常用于咯血，吐血，崩漏下血，瘧疾，血痢，癰腫瘡毒，陰癢帶下，脫力勞傷[2]?，F(xiàn)代研究表明，仙鶴草藥用成分復(fù)雜，主要含有黃酮、三萜、異香豆素及有機(jī)酸類成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等多種藥理活性[3]。

2015年版《中國藥典》對仙鶴草藥材的質(zhì)量控制僅收載鑒別和檢查項(xiàng)，尚缺乏含量測定指標(biāo)，文獻(xiàn)對仙鶴草藥材質(zhì)量控制的研究較少，含量測定指標(biāo)主要選擇芹菜素、木樨草素等黃酮苷元類成分[4]，該類成分含量較低，缺乏專屬性，且產(chǎn)地、采收加工等因素對藥材的含量影響較大，不利于質(zhì)量的控制[5]。本研究采用含量測定與特征圖譜相結(jié)合的質(zhì)量控制模式，通過采用高效液相色譜法，建立了仙鶴草藥材的HPLC特征圖譜，并對仙鶴草的主要有效成分槲皮苷進(jìn)行定量分析，結(jié)合相似度計(jì)算及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，評價(jià)不同產(chǎn)地的仙鶴草藥材質(zhì)量，為仙鶴草藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀，CHEMSTATION C.01.04化學(xué)工作站（安捷倫公司），Waters高效液相色譜儀（e2695，沃特斯公司），百萬分之一分析天平（XP26，梅特勒-托利多公司），十萬分之一天平（ABT220-5DM，廣州得翔科技有限公司），萬分之一分析天平（ME204E，梅特勒-托利多公司），數(shù)控超聲清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司），超純水機(jī)（MiliQ Direct 8，默克密理博公司），電熱恒溫水浴鍋（HWS28，上海一恒科技有限公司）。

1.2?試藥?甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）為色譜級，水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其余試劑為分析純。槲皮苷對照品（批號：111538-201606，含量以90.6%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院提供）;研究所用仙鶴草藥材由廣東一方制藥有限公司采購管理部收集，經(jīng)魏梅主任中藥師鑒定分別為薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，經(jīng)檢驗(yàn)，符合《中國藥典》2015年版一部“仙鶴草”項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，具體信息見表1。

2?方法與結(jié)果

2.1?仙鶴草特征圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)建立

2.1.1?色譜條件?Waters XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色譜柱;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～30min，22%～35%A;30～32min，35%A;32～33min，35～22%A;33～40min，22%A）;流速為每分鐘1.0mL;柱溫為30℃;檢測波長為320nm;進(jìn)樣量為10 μl。

2.1.2?參照物溶液的制備?取槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，作為對照品參照物溶液。

2.1.3?供試品溶液的制備?取仙鶴草藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4?方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.4.1?專屬性試驗(yàn)?取空白溶劑、“2.1.2”項(xiàng)下參照物溶液及“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，供試品色譜中在與對照品參照物溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，說明該方法專屬性良好。

2.1.4.2?精密度試驗(yàn)?取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，與槲皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3?重復(fù)性試驗(yàn)?取藥材粉末約0.5 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，與槲皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣分析，與槲皮苷參照物峰相對應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3.0%，說明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5?HPLC特征圖譜的構(gòu)建與評價(jià)

2.1.5.1?特征圖譜的建立?取25批仙鶴草藥材，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以編號為S1樣品的特征圖譜為參照圖譜，以3號峰為Mark峰進(jìn)行保留時(shí)間校正，并進(jìn)行全峰匹配，以平均數(shù)法生成對照特征圖譜，見圖1。

2.1.5.2?特征圖譜結(jié)果分析?選擇分離度較好、色譜峰純度較高的7個(gè)共有峰為該特征圖譜的特征峰，通過對照品指認(rèn)出峰3為槲皮苷，以峰3為參照峰S，計(jì)算其他特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，25批仙鶴草藥材峰1～峰7的相對保留時(shí)間均值為0.77（峰1）、0.96（峰2）、1.00（峰3）、1.13（峰4）、1.36（峰5）、2.07（峰6）、2.28（峰7）;

相對峰面積范圍分別為0.316～0.712（峰1）、0.111～0.449（峰2）、1.246～3.303（峰4）、0.069～0.206（峰5）、0.564～4.211（峰6），0.078～0.198（峰7），結(jié)果見表2。

2.1.5.3?相似度評價(jià)?對25批仙鶴草藥材特征圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，與對照特征圖譜比較，除編號為S20的藥材外，其余24批相似度均大于0.95，說明不同產(chǎn)地的仙鶴草藥材整體質(zhì)量比較穩(wěn)定，相似度評價(jià)表見表3。

2.1.5.4?聚類分析?采用SPSS 20.0軟件，以7個(gè)特征峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接方法對25批藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2，由結(jié)果可知，當(dāng)判別條件距離為10時(shí)，25批仙鶴草藥材被大致分為3類，第一類包括S1、S2、S3、S6、S8、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S21、S22、S23、S24、S25，聚集了浙江、安徽、四川、河南、江蘇5個(gè)產(chǎn)地的藥材;第二類包括S4、S5、S7、S9，聚集了安徽、四川兩個(gè)產(chǎn)地的仙鶴草藥材;S20樣品獨(dú)自聚為一類，說明該批次藥材與其他批次質(zhì)量差異相對較大，與相似度評價(jià)結(jié)果相類似，該差異可能與藥材的采收、產(chǎn)地加工等因素有關(guān)。

2.1.5.5?主成分分析?以7個(gè)特征峰的峰面積為變量進(jìn)行主成分分析，以主成分特征值大于1為提取原則，根據(jù)表4的結(jié)果提取了2個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82.88%，表明該2個(gè)主成分能代表7個(gè)共有峰在25批樣品中82.88%的信息。根據(jù)主成分載荷矩陣系數(shù)（表5），

可以看出，峰1、峰4對主成分1的影響最大，峰3、峰6對主成分2的影響最大。以主成分1、主成分2的得分分別為橫、縱坐標(biāo)，生成25個(gè)樣品主成分得分圖，從圖3和表6的結(jié)果中可以看出，編號為S20的仙鶴草藥材主成分2得分值明顯高于其他樣品，離群也較遠(yuǎn)，編號為S4、S5、S7、S9的仙鶴草藥材主成分1得分值明顯高于其他樣品，可以劃為一類，其余20批藥材歸為一類，由于主成分1和2的主要貢獻(xiàn)權(quán)重為峰1、3、4和6，因此，特征峰1、3、4、6為造成仙鶴草藥材不同產(chǎn)地差異性的關(guān)鍵色譜峰。主成分分析同樣將仙鶴草藥材分為3類，這與聚類分析的結(jié)果一致。

2.2?槲皮苷含量測定

2.2.1?色譜條件?Waters XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）為流動(dòng)相;檢測波長為254nm;進(jìn)樣量為10μl;理論板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于7000。

2.2.2?對照品溶液的制備?精密稱取槲皮苷對照品3.216mg，至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3?供試品溶液的制備?取仙鶴草藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4?線性關(guān)系考察?精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，加甲醇分別制備濃度為3.64、7.28、14.57、29.14、58.27、116.55μg·mL-1的對照品稀釋溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=29.9060X-6.2115，r=0.9999。結(jié)果表明槲皮苷在濃度為3.64～116.55μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5?精密度試驗(yàn)?精密吸取同一份對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定槲皮苷對照品峰面積的RSD為0.27%，說明儀器精密度良好。

2.2.6?重復(fù)性試驗(yàn)?精密稱取同一批樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算槲皮苷含量的RSD為0.57%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取同一供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，分別于0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)樣，測定槲皮苷峰面積的RSD為0.40%，說明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8?加樣回收試驗(yàn)?精密稱定已知含量的仙鶴草藥材粉末約0.25 g，共9份，分為3組，每組3份，分別按樣品與對照品之比為1：0.5，1：1以及1：1.5的比例加入對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果本方法準(zhǔn)確度良好，平均回收率為96.92%，RSD為1.29%。

2.2.9?樣品測定?取25批仙鶴草藥材，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定并計(jì)算槲皮苷含量，結(jié)果見表7。結(jié)果顯示，槲皮苷含量范圍為0.09%～0.20%，最大值和最小值不超過3倍，說明不同產(chǎn)地仙鶴草藥材槲皮苷的含量差異并不大，考慮到25批樣品的代表性，若取含量均值的70%為下限來制定槲皮苷的含量限度標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量合格的仙鶴草藥材中槲皮苷的含量應(yīng)不低于0.10%。

3?討論

3.1?樣品制備及色譜條件考察?在特征圖譜的構(gòu)建過程中，以特征峰的總峰面積/稱樣量為考察指標(biāo)，通過單因素分析，分別考察了提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間和溶劑用量對仙鶴草特征圖譜的影響，最終確定以50%乙醇50mL作為提取溶劑，加熱回流30分鐘作為樣品的前處理方法?？疾炝艘译?0.1%磷酸，甲醇-水，甲醇-0.1%磷酸3種流動(dòng)相的洗脫效果，結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，色譜峰信息量最大，基線較平穩(wěn);考察仙鶴草不同吸收波長（320nm、254nm、280nm、360nm）下的特征圖譜，結(jié)果顯示，在320nm下各特征峰的整體吸收較高，故選用320nm為檢測波長。

3.2?特征峰的指認(rèn)及特征圖譜標(biāo)準(zhǔn)的確立?仙鶴草藥材特征圖譜共有7個(gè)特征峰，采用對照品比對及光譜分析，確認(rèn)特征峰3為槲皮苷，以峰3為S峰，采用相對保留時(shí)間進(jìn)行定位，各特征峰的相對保留時(shí)間分別為0.77（峰1）、：0.96（峰2）、1.13（峰4）、1.36（峰5）、2.07（峰6）及2.28（峰7），為嚴(yán)格控制仙鶴草質(zhì)量，對各特征峰的相對峰面積設(shè)定限量標(biāo)準(zhǔn)，考慮到25批樣品的代表性，取各特征峰相對峰面積的最低、最高值，規(guī)定特征峰1～7的相對峰面積范圍，分別為0.316～0.712（峰1），0.111～0.449（峰2），1.246～3.303（峰4），0.069～0.206（峰5），0.564～4.211（峰6）及0.078～0.198（峰7）。

3.3?聚類分析和主成分分析?聚類分析將25批藥材分成3類，其中編號S4、S5、S7、S9的藥材為一類，S20獨(dú)自聚成一類，其余20批藥材為一類。利用主成分分析法，將7個(gè)特征峰變量降維為2個(gè)主成分變量，確定影響仙鶴草藥材分類的關(guān)鍵色譜峰為峰1、峰3、峰4及峰6，編號為S4、S5、S7、S9和S20的樣品，因峰1、峰3、峰4及峰6的峰面積與其他20批差異較大，因此各成一類，這種差異可能與藥材的采收或產(chǎn)地加工有關(guān)。

3.4?含量測定?槲皮苷具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種藥理作用[6]，是仙鶴草的主要有效成分之一，研究顯示，相較于其他黃酮類，該成分在仙鶴草中含量較高，穩(wěn)定性較好[7]，因此，選擇槲皮苷作為仙鶴草的含量測定指標(biāo)。研究顯示，25批仙鶴草藥材的槲皮苷含量范圍為0.09%～0.22%，且最大值與最小值不超過3倍，表明不同產(chǎn)地仙鶴草藥材槲皮苷的含量較穩(wěn)定，不同產(chǎn)地之間差異性較小。

本研究建立的特征圖譜和含量測定方法重現(xiàn)性良好，樣品制備簡單，分析時(shí)間短。采用特征圖譜結(jié)合含量測定能更好地評價(jià)仙鶴草的質(zhì)量，為仙鶴草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

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（收稿日期：2020-05-27）