丁振中 雷鵬 張超 鄧紅兵

[摘 要] 本研究以油菜苗為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)施用殼寡糖對(duì)常溫（對(duì)照）及低溫條件下的油菜苗進(jìn)行處理，以此探究殼寡糖對(duì)油菜幼苗抗低溫脅迫的影響。結(jié)果表明，施用殼寡糖的油菜苗在低溫處理144 h后，其鮮質(zhì)量及葉綠素含量分別較低溫對(duì)照組提高了37.93%和48.25%;丙二醛含量較低溫對(duì)照組降低了35.3%;脯氨酸含量較低溫對(duì)照組提升了62.5%;總抗氧化能力較低溫對(duì)照組顯著提升，且殼寡糖能激發(fā)Ca2+向胞質(zhì)流動(dòng)。

[關(guān)鍵詞] 油菜;殼寡糖;低溫脅迫

[中圖分類(lèi)號(hào)] S512.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1674-7909（2020）31-80-3

低溫凍害是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)的一種非生物脅迫，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響巨大。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2006—2015年，受低溫冷害影響，我國(guó)作物受災(zāi)面積達(dá)0.41億hm2，成災(zāi)面積高達(dá)0.19億hm2，絕收面積368.47萬(wàn)hm2。以2008年為例，我國(guó)有21個(gè)省、市、自治區(qū)受低溫冷害危害，農(nóng)業(yè)直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)300億元。近幾年，氣候?qū)W家研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)低溫冷害發(fā)生概率逐漸增加，因此，提高作物抗低溫脅迫的能力將是保證我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要研究方向。

近年來(lái)，各類(lèi)農(nóng)業(yè)相關(guān)產(chǎn)品不斷出現(xiàn)。其中，生物刺激素是一類(lèi)能夠作用于植物或植物根際，使植物自身生命活動(dòng)增強(qiáng)從而間接增強(qiáng)植物營(yíng)養(yǎng)吸收或增強(qiáng)非生物脅迫抵抗能力的物質(zhì)。目前，已被認(rèn)可的典型生物刺激素有腐植酸、幾丁質(zhì)、殼寡糖等[1]，當(dāng)前我國(guó)關(guān)于殼寡糖對(duì)油菜苗抗低溫脅迫的相關(guān)研究較少。因此，本研究以油菜苗為研究對(duì)象，探究殼寡糖對(duì)油菜苗抗低溫脅迫能力的影響，并初步探究其抗低溫脅迫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)以甘藍(lán)型油菜蘇油1號(hào)為研究對(duì)象，種子消毒催芽約3 d后，將露白的種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中并放于光照培養(yǎng)室，控制光照時(shí)間為16 h，光培養(yǎng)溫度控制在25℃，暗培養(yǎng)溫度控制在15 ℃，濕度控制在65%。油菜苗生長(zhǎng)28 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜苗轉(zhuǎn)入水培盒（34 cm×23 cm×10 cm）進(jìn)行水培培養(yǎng)，水培時(shí)使用1/2改良的霍格蘭（Hoagland）營(yíng)養(yǎng)液。水培7 d，待油菜苗適應(yīng)水培環(huán)境后，開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2 低溫脅迫試驗(yàn)處理

試驗(yàn)分組如表1所示。其中，油菜苗除培養(yǎng)溫度及殼寡糖用量不同外，其他條件均保持一致。營(yíng)養(yǎng)液每24 h按處理更換一次，試驗(yàn)中于24 、48 、72 、96 、120 h及144 h取樣進(jìn)行生長(zhǎng)及生理指標(biāo)檢測(cè)。

表1 低溫脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?/℃

[組號(hào) 組名 基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液 培養(yǎng)溫度/℃ 殼寡糖添加（mg/kg） 1 CK 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 25 0 2 COS 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 25 20 3 LT 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 4 0 4 LT+COS 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 4 20 ]

注：CK代表常溫，LT代表低溫脅迫，COS代表常溫下殼聚糖處理，LT+COS代表低溫脅迫下殼聚糖處理。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 生物量測(cè)定。測(cè)定鮮質(zhì)量時(shí)，每個(gè)處理每次取樣不少于6株苗，每株單獨(dú)稱(chēng)量，先將油菜苗根部的營(yíng)養(yǎng)液吸干，然后稱(chēng)量樣品，取平均值，即可獲得油菜苗鮮質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素含量測(cè)定。稱(chēng)取0.5 g葉片組織，剪碎后置于50 mL乙醇-丙酮（1：1）混合溶液中，在黑暗室溫條件下脫色48 h;浸提液經(jīng)10 000 g離心5 min，過(guò)濾后，測(cè)定濾液在645 nm和663 nm波長(zhǎng)下的吸光值。葉綠素含量依據(jù)Arnon提出的公式計(jì)算[2]。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量測(cè)定。MDA含量的測(cè)定參考自Liu等人的方法[3]。

1.3.4 脯氨酸測(cè)定。脯氨酸含量的測(cè)定參考自Bates的方法[4]。

1.3.5 總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定?？偪寡趸芰y(cè)定使用FRAP法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 胞內(nèi)自由Ca2+[（Ca2+）cyt]含量測(cè)定。為測(cè)定（Ca2+）cyt含量，首先按照姜秀梅等的方法制備葉肉原生質(zhì)體。分離得到的原生質(zhì)體使用熒光染料Fluo-3/Amester在4 ℃下培養(yǎng)1 h，然后繼續(xù)在25 ℃條件下培養(yǎng)1 h;接著將原生質(zhì)體置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，每隔30 s掃描一次熒光強(qiáng)度;利用計(jì)算機(jī)控制掃描及數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，對(duì)樣品Ca2+熒光強(qiáng)度和分布進(jìn)行高分辨圖像和數(shù)據(jù)記錄[5]。其中，培養(yǎng)液中包含10 mmol/L鈣離子熒光探針（Fluo-3/Amester）、0.4 mol/L甘露醇、20 mmol/L氯化鉀和5 mmol/L MES緩沖液（pH 值為5.7）。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗生長(zhǎng)量及葉綠素含量的影響

如表2所示，常溫時(shí)，殼寡糖（COS）提高了油菜苗的鮮質(zhì)量及葉綠素含量，尤其是處理96 h后。處理144 h后，對(duì)照+殼聚糖組中油菜苗的鮮質(zhì)量及葉綠素含量分別較對(duì)照組提高了12.03%和19.53%。低溫脅迫下，油菜苗的生長(zhǎng)受到明顯抑制，與對(duì)照組相比，低溫處理144 h后，油菜苗鮮質(zhì)量及葉綠素含量分別降低了49.63%和55.42%。與低溫脅迫組相比，低溫脅迫+殼聚糖組油菜苗鮮質(zhì)量及葉綠素含量在低溫處理144 h后分別提高了37.93%和48.25%。由此可見(jiàn)，殼聚糖能顯著緩解低溫脅迫對(duì)油菜苗的生長(zhǎng)抑制。在試驗(yàn)過(guò)程中，常溫對(duì)照條件下油菜苗生長(zhǎng)旺盛，葉片鮮綠，而低溫條件下組油菜苗出現(xiàn)葉片萎蔫，但低溫脅迫+殼聚糖組油菜苗的葉片并未出現(xiàn)萎蔫。

2.2 低溫脅迫下，殼聚糖對(duì)油菜苗丙二醛含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量的活性氧（ROS），從而對(duì)植物細(xì)胞造成氧化脅迫。丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，一般可用MDA的濃度反映植物細(xì)胞受損傷的程度。如圖1所示，在常溫條件下，對(duì)照組與COS組油菜苗葉片中的MDA含量無(wú)顯著差異;低溫條件下，LT組與LT+COS組油菜苗葉片中的MDA含量急劇增加。低溫處理144 h后，LT組油菜苗葉片MDA含量較對(duì)照組提高了2.7倍;與對(duì)照組相比，LT+COS組油菜苗葉片中的MDA含量同樣顯著增加，但增加量顯著低于LT組。低溫處理144 h后，LT+COS組油菜苗葉片中的MDA含量較LT組下降了35.3%。這表明殼聚糖可減輕低溫脅迫下油菜苗的細(xì)胞損傷。

2.3 低溫脅迫下殼聚糖對(duì)油菜苗脯氨酸含量的影響

當(dāng)植物處于脅迫環(huán)境中時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓會(huì)出現(xiàn)失衡現(xiàn)象，植物通常會(huì)通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫，脯氨酸是一種常見(jiàn)的植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。從圖2可知，在常溫環(huán)境中，COS組植物葉片中的脯氨酸含量較對(duì)照組增加。施加殼聚糖144 h后，COS組油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量是對(duì)照組的2.8倍。低溫處理后，LT組及LT+COS組油菜苗葉片中的脯氨酸含量顯著升高，LT+COS組脯氨酸含量長(zhǎng)時(shí)顯著高于LT組;低溫處理144 h后，LT+COS組油菜苗葉片中的脯氨酸含量較LT組要高出62.5%。這表明殼聚糖促進(jìn)了油菜苗葉片中脯氨酸的積累，且該效果在低溫環(huán)境中更加明顯。

2.4 低溫脅迫下殼聚糖對(duì)油菜總抗氧化能力的影響

當(dāng)?shù)蜏孛{迫出現(xiàn)時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量的活性氧ROS，從而對(duì)植物細(xì)胞造成氧化脅迫[6]。在研究過(guò)程中，本試驗(yàn)對(duì)各試驗(yàn)組油菜苗葉片總抗氧化能力（T-AOC）進(jìn)行了測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能顯著提升低溫環(huán)境下油菜苗的總抗氧化能力，如圖3所示。

2.5 低溫脅迫下，殼聚糖對(duì)油菜苗葉片內(nèi)Ca2+流的影響

在常溫環(huán)境中，植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自由Ca2+含量非常少，大部分的Ca2+均被固定在液泡內(nèi)或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到來(lái)自環(huán)境的刺激時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)的自由Ca2+水平會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速提高，從而調(diào)控下游靶點(diǎn)的生理變化。如圖4所示，與對(duì)照組相比，COS組葉片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+表現(xiàn)出明顯的波動(dòng)。在施加COS的前72 h中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平顯著提高，之后Ca2+含量開(kāi)始降低并在96 h后回到最初水平。此外，低溫脅迫條件下，導(dǎo)致油菜苗葉片胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平在處理后的48 h內(nèi)急劇上升，但LT+COS組中的Ca2+水平在48 h后逐漸開(kāi)始下降，并在120 h后降低到接近對(duì)照組水平。相反地，LT組中Ca2+水平始終保持在較高水平，且顯著高于初始水平。

3 結(jié)論

本研究采用水培方式，考察了低溫條件（4 ℃）下，殼聚糖對(duì)油菜苗生長(zhǎng)及生理生化的影響，結(jié)果表明：在低溫脅迫下，與LT組相比LT+COS組油菜苗的鮮質(zhì)量及葉綠素含量在低溫處理144 h后分別提高了37.93%和48.25%;在低溫脅迫條件下，殼聚糖對(duì)油菜苗葉片細(xì)胞的脯氨酸積累和總抗氧化能力有所增強(qiáng)，在一定程度上緩解了低溫脅迫引起的MDA增加及葉綠素降解，緩解了低溫對(duì)油菜苗的損傷。此外，細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度受殼聚糖影響呈波動(dòng)趨勢(shì)，這可能是由于殼聚糖通過(guò)響應(yīng)Ca2+信號(hào)來(lái)調(diào)控油菜苗細(xì)胞內(nèi)的生理變化，從而增強(qiáng)其抗低溫能力。

參考文獻(xiàn)

[1]張洪勝.生物刺激素行業(yè)發(fā)展概述[J]煙臺(tái)果樹(shù)，2016（2）：1-3.

[2]唐銀鳳.葉綠素含量測(cè)定中Arnon公式的系數(shù)誤差對(duì)結(jié)果的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（3）：48.

[3]Gu-Wen Zhang，Zheng-Lu Liu，Jun-Guo Zhou，et alEffects of Ca（NO3）2 stress on oxidative damage，antioxidant enzymes activities and polyamine contents in roots of grafted and non-grafted tomato plants[J].Plant Growth Regulation，2008（1）：234-235.

[4]J.C. Pinheiro，D.M. Bates. Approximations to the loglikelihood function in the nonlinear mixed effects model[J].Journal of Computational and Graphical Statistics，1995（6）：27.

[5]姜秀梅.外源物質(zhì)處理對(duì)低溫脅迫下辣椒種子萌發(fā)及幼苗抗冷性的影響[J]新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（3）：229-233.

[6]張騰國(guó).MAPKK抑制劑對(duì)低溫脅迫下油菜幼苗光合作用和抗氧化酶活性的影響[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013（1）：92-99.