劉 琦，武毓琦，吳 茜，趙 柔，韓曉燕*，張 毅

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 300193)

藤黃酸(gambogic acid，GA)是從中藥藤黃中提取的一種弱酸性化學(xué)物質(zhì)，具有廣泛的抗腫瘤活性[1-2]。GA在水中的溶解度極小，穩(wěn)定性較差且在體內(nèi)半衰期短，極大地限制了其臨床應(yīng)用。目前，大多采用注射劑、納米粒、脂質(zhì)體等構(gòu)建GA靶向納米藥物遞送系統(tǒng)，以改善其不足。

層狀雙金屬氫氧化物(layered double hydroxides，LDH)[3-4]是由帶正電荷的主體層板和層間陰離子通過非共價鍵的相互作用組裝而成的一類無機(jī)層狀納米材料，具有優(yōu)異的離子交換能力和生物相容性，作為新型的藥物緩釋載體被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。常見的LDH類型為MgAl-LDH。研究表明，CaAl-LDH可提供短期持續(xù)和高振幅的Ca2+，誘導(dǎo)線粒體水平升高，促使癌細(xì)胞凋亡[5]，從而增強(qiáng)抗癌作用。

為探討GA和CaAl-LDH的協(xié)同抗腫瘤作用，作者采用水熱法制備載體CaAl-LDH，利用LDH層間陰離子的可交換性，將GA插入CaAl-LDH層間制備載藥復(fù)合物GA/CaAl-LDH，通過FTIR、XRD對CaAl-LDH和GA/CaAl-LDH進(jìn)行表征，采用正交實驗優(yōu)化制備工藝，并研究其緩沖性能。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

藤黃酸，南京春秋生物工程有限公司。

二水氯化鈣、六水氯化鋁，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；其它試劑均為分析純。

ME104E/02型萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；ZKXFB-2型電熱真空干燥箱，上海樹立儀器儀表有限公司；SCIENTZ-950E型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀，日本島津公司；Varian 640型傅立葉變換紅外光譜儀；Miniflex 600型X-射線粉末衍射儀。

1.2 載體CaAl-LDH的制備

取二水氯化鈣、六水氯化鋁溶于200 mL去CO2的去離子水中，使Ca/Al值(Ca與Al物質(zhì)的量比)分別為2∶1、3∶1、4∶1，N2保護(hù)下緩慢滴入1.26 mol·L-1NaOH溶液將pH值調(diào)至11，常溫磁力攪拌24 h后，陳化5 h；過濾，沉淀用去離子水洗凈后分散于100 mL去CO2的去離子水中，150 ℃下水熱8 h；過濾，沉淀水洗2次，于65 ℃真空干燥24 h，即得不同Ca/Al值的白色塊狀物CaAl-LDH。

1.3 載藥復(fù)合物GA/CaAl-LDH的制備

參照文獻(xiàn)[6]方法，取0.25 g不同Ca/Al值的CaAl-LDH溶于60 mL去離子水中，超聲分散制成混懸液；同時取0.05 g GA溶于30 mL甲醇中；兩者混合，N2保護(hù)下60 ℃、500 r·min-1反應(yīng)10 h；過濾，沉淀水洗2次、乙醇洗2次，于40 ℃真空干燥24 h，即得不同Ca/Al值的GA/CaAl-LDH。

1.4 CaAl-LDH及GA/CaAl-LDH的結(jié)構(gòu)表征

分別通過FTIR和XRD對CaAl-LDH、GA/CaAl-LDH的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.5 GA/CaAl-LDH中GA含量的測定

參照文獻(xiàn)[7]方法，進(jìn)行GA含量測定方法學(xué)考察，得到GA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=15002c+1419.3(R=0.9998)。精密稱取10 mg GA/CaAl-LDH置于10 mL容量瓶中，滴加2滴濃H3PO4破壞載藥復(fù)合物，加入甲醇溶解GA并定容；經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，吸取20 μL，按色譜條件[7]進(jìn)樣測定。將峰面積代入GA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得GA含量，再分別按式(1)、(2)計算包封率和載藥量：

(1)

(2)

1.6 GA/CaAl-LDH的制備工藝優(yōu)化

在確定最佳Ca/Al值的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度、藥載比(藥物與載體的質(zhì)量比)、反應(yīng)時間、轉(zhuǎn)速為考察因素，以載藥量為指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交實驗，優(yōu)化GA/CaAl-LDH制備工藝。正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平

1.7 GA/CaAl-LDH的緩沖性能測試

在最佳工藝條件下制備載藥復(fù)合物GA/CaAl-LDH，滴加0.1 mol·L-1HCl溶液制成懸浮液，測定溶液pH值，以HCl溶液消耗體積為橫坐標(biāo)、溶液pH值為縱坐標(biāo)繪制緩沖曲線，評價其緩沖性能[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 CaAl-LDH及GA/CaAl-LDH的表征

2.1.1 FTIR分析(圖1)

從圖1可知，CaAl-LDH在3 635 cm-1和3 489 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，歸因于LDH層板上的O-H和LDH層間水分子的O-H伸縮振動，1 620 cm-1處的吸收峰歸因于LDH層間水分子的O-H彎曲振動，400～800 cm-1處的吸收峰是由M-O、M-O-M和O-M-O(M=Ca、Al)的拉伸振動引起的，與文獻(xiàn)[9]報道一致。GA/CaAl-LDH的FTIR圖譜中出現(xiàn)了GA的特征吸收峰：2 925 cm-1、2 969 cm-1處甲基和亞甲基的吸收峰，1 416 cm-1、1 547 cm-1、1 594 cm-1處苯環(huán)骨架伸縮振動峰，1 736 cm-1處羧酸的C=O伸縮振動峰。表明，GA成功插入CaAl-LDH層間。

圖1 CaAl-LDH、GA、GA/CaAl-LDH的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of CaAl-LDH,GA,and GA/CaAl-LDH

2.1.2 XRD分析(圖2)

a.CaAl-LDH b.GA/CaAl-LDH

從圖2可知，CaAl-LDH的尖峰主要集中在11.48°、22.92°、23.54°和31.18°處，分別對應(yīng)六邊形晶體系統(tǒng)中的(002)、(004)、(112)和(020)晶面，進(jìn)一步計算出晶胞參數(shù)a=9.85 ?、b=5.72 ?、c=16.89 ?，證明CaAl-LDH的晶體結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)[10]報道的一致。此外，在制備CaAl-LDH的過程中，同時產(chǎn)生水鈣鋁榴石(katoite)和碳酸鈣副產(chǎn)物，推測可能是水解反應(yīng)時溶液中鹽離子較少導(dǎo)致水鈣鋁榴石的形成。與CaAl-LDH比較，GA/CaAl-LDH的(002)晶面對應(yīng)的2θ向低角度移動，層間距增大，這是由于GA分子插入CaAl-LDH層間時引起晶格結(jié)構(gòu)膨脹，進(jìn)一步驗證載藥成功。

2.2 最佳Ca/Al值的確定

以不同Ca/Al值的CaAl-LDH制備的GA/CaAl-LDH的載藥效果見表2。

從表2可知，當(dāng)Ca/Al值為2∶1時，GA/CaAl-LDH的載藥量最大。這是因為，隨著Ca/Al值的減小，CaAl-LDH層板的正電荷密度逐漸增大，CaAl-LDH與GA之間的靜電相互作用逐漸增強(qiáng)，載藥量相應(yīng)增大。因此，選擇Ca/Al值為2∶1的CaAl-LDH制備GA/CaAl-LDH。

表2 不同Ca/Al值的GA/CaAl-LDH的載藥效果

2.3 最佳制備工藝的確定

GA/CaAl-LDH制備工藝優(yōu)化的正交實驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 L9(34)正交實驗結(jié)果

表4 方差分析

從表3可知，各因素對GA/CaAl-LDH載藥量的影響大小為：B>A>C>D，即藥載比的影響最大，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間次之，轉(zhuǎn)速最小；最佳制備工藝為A1B3C1D3，即反應(yīng)溫度40 ℃、藥載比1∶1、反應(yīng)時間6 h、轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1。從表4可知，因素B的P值<0.01，即藥載比對載藥量影響極顯著。

2.4 GA/CaAl-LDH的緩沖性能

CaAl-LDH和GA/CaAl-LDH的緩沖曲線如圖3所示。

圖3 CaAl-LDH(a)和GA/CaAl-LDH(b)的緩沖曲線Fig.3 Buffering curves of CaAl-LDH(a) and GA/CaAl-LDH(b)

從圖3可知，載體CaAl-LDH的主要緩沖作用在pH值4.4處，推測CaAl-LDH的緩沖性能可能歸因于層間的羥基，這也是它作為抗酸劑的原因；而載藥復(fù)合物GA/CaAl-LDH的緩沖曲線與載體CaAl-LDH的相近，具有與載體CaAl-LDH相同的緩沖性能，主要緩沖作用在pH值4.2處。

3 結(jié)論

首先采用水熱法成功制備了CaAl-LDH，然后采用離子交換法將GA插入到CaAl-LDH層間制備載藥復(fù)合物GA/CaAl-LDH，最佳制備工藝為：Ca/Al值為2∶1、反應(yīng)溫度40 ℃、藥載比1∶1、反應(yīng)時間6 h、轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1。該載藥復(fù)合物具有良好的載藥性能和緩沖性能，CaAl-LDH有望成為一種新型的中藥抗腫瘤成分高效載體。