趙婷婷，何承輝，譚梅娥，孫玉華*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

前列爽顆粒，是新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院按照現(xiàn)代中醫(yī)理論組方的經(jīng)驗(yàn)方，有多年的臨床應(yīng)用。具有清熱利濕、活血通溺、補(bǔ)虛導(dǎo)濁的功效，用于治療脾腎兩虛、濕熱瘀阻所致慢性非細(xì)菌性前列腺炎[1]。處方由關(guān)黃柏、王不留行(炒)、車前子等五味藥材組成，其中關(guān)黃柏含有生物堿類等有效成分如鹽酸小檗堿、藥根堿、巴馬汀等[2]，王不留行(炒)含有黃酮類等有效成分如王不留行黃酮苷等[3]，車前子含有苯乙醇苷類等有效成分如毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷等[4]。這些成分具有抗菌、抗癌、抗炎、降脂等作用[2-4]。

作者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以醇提液中鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的轉(zhuǎn)移率及醇浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法進(jìn)行比較分析，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間等因素進(jìn)行考察，構(gòu)建前列爽顆粒醇提工藝優(yōu)選模型，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為前列爽顆粒的研發(fā)提供穩(wěn)定、可行的生產(chǎn)工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

關(guān)黃柏、車前子、王不留行(炒)，購于亳州華云中藥飲片有限公司，均符合《中華人民共和國藥典》(一部)2015 年版相關(guān)項(xiàng)規(guī)定。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-201212)、王不留行黃酮苷對(duì)照品(批號(hào)111853-201704)、毛蕊花糖苷對(duì)照品(批號(hào)111530-201512)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈，色譜純，美國Fisher公司；自制超純水。

KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；UV-765型紫外分光光度儀，上海精科；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，北京光明醫(yī)療儀器廠；BP211D型、BS110S型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司； KDM型調(diào)溫電熱套，山東鄄城永興儀器廠；超純水機(jī)，四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 溶液的制備

1.2.1 鹽酸小檗堿對(duì)照溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品，用60%乙醇溶解，配制成濃度為534 μg·mL-1的儲(chǔ)備液；再精密量取1.5 mL儲(chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，搖勻，即得濃度為80.1 μg·mL-1的鹽酸小檗堿對(duì)照溶液。

1.2.2 王不留行黃酮苷對(duì)照溶液的制備

精密稱取王不留行黃酮苷對(duì)照品，用70%甲醇溶解，配制成濃度為551 μg·mL-1的儲(chǔ)備液；再精密量取1 mL儲(chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，搖勻，即得濃度為55.1 μg·mL-1的王不留行黃酮苷對(duì)照溶液。

1.2.3 毛蕊花糖苷對(duì)照溶液的制備

精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品，用60%甲醇溶解，配制成濃度為556 μg·mL-1的儲(chǔ)備液；再精密量取3 mL儲(chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中，用60%甲醇定容，搖勻，即得濃度為166.8 μg·mL-1的毛蕊花糖苷對(duì)照溶液。

1.2.4 供試溶液的制備

分別稱取處方量的關(guān)黃柏、王不留行(炒)、車前子，加入乙醇，加熱回流提取，過濾，濾液置于1 000 mL容量瓶中，定容，即得供試溶液。

1.2.5 陰性對(duì)照溶液的制備

分別稱取處方量的藥材3份，每份分別缺關(guān)黃柏、缺王不留行(炒)、缺車前子，按1.2.4方法制備陰性對(duì)照溶液。

1.3 色譜條件

參照《中華人民共和國藥典》(一部)2015年版中關(guān)黃柏、王不留行(炒)、車前子藥材的含量測(cè)定方法[5]選擇色譜條件。

鹽酸小檗堿的色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液[0～60 min，25∶75(體積比，下同)；加入磷酸二氫鈉使其濃度達(dá)到0.02 mol·L-1]為流動(dòng)相，檢測(cè)波長345 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿色譜峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。

王不留行黃酮苷的色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液(0～40 min，10∶90；40～60 min，25∶75；60～70 min，10∶90；70～75 min，10∶90；加入磷酸二氫鈉使其濃度達(dá)到0.02 mol·L-1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長280 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1，理論板數(shù)以王不留行黃酮苷色譜峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。

毛蕊花糖苷的色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%醋酸溶液(0～20 min，13∶87；20.01～50 min，17∶83；50.01～55 min，13∶87)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長334 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，理論板數(shù)以毛蕊花糖苷色譜峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

1.4 醇浸膏得率的測(cè)定

先將蒸發(fā)皿恒重，再精密吸取25.0 mL供試溶液于蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上蒸干，于105 ℃烘箱中干燥3 h后立即取出，于干燥器中冷卻30 min，精密稱定，按下式計(jì)算醇浸膏得率：

1.5 醇提工藝的優(yōu)化

前期單因素實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)提取率影響較大的是乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為考察因素，以鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的轉(zhuǎn)移率和醇浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化前列爽顆粒醇提工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜(圖1)

a.鹽酸小檗堿對(duì)照 b.鹽酸小檗堿樣品 c.鹽酸小檗堿陰性對(duì)照 d.王不留行黃酮苷對(duì)照 e.王不留行黃酮苷樣品

由圖1可以看出，鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的HPLC圖譜的峰形良好，分離度佳，陰性無干擾。表明所選擇的色譜條件可用于鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的含量測(cè)定。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別稱取關(guān)黃柏、王不留行(炒)、車前子各15 g，按表1設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，提取2次，濾液置于1 000 mL容量瓶中，定容，進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的轉(zhuǎn)移率和醇浸膏得率，結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果/%

2.3 指標(biāo)權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法

2.3.1 AHP法

AHP(層次分析)法是主觀權(quán)重賦權(quán)法[6]。根據(jù)前列爽顆粒中處方配伍特點(diǎn)、活性成分含量及藥理作用，將表1中鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的轉(zhuǎn)移率和醇浸膏得率等4個(gè)指標(biāo)給予量化，確定4個(gè)指標(biāo)的重要程度為：鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率>王不留行黃酮苷轉(zhuǎn)移率>毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率>醇浸膏得率，據(jù)此進(jìn)行成對(duì)比較，得到4個(gè)指標(biāo)的優(yōu)先矩陣(表2)[7]。采用AHP 法計(jì)算得到鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率、王不留行黃酮苷轉(zhuǎn)移率、毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率、醇浸膏得率等4個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為0.482 41、0.271 80、0.157 51、0.088 29。

表2 成對(duì)比較4個(gè)指標(biāo)的優(yōu)先矩陣

采用AHP法計(jì)算權(quán)重系數(shù)時(shí)，需要按式(1)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)：

CR=CI/RI

(1)

式中：CR為隨機(jī)一致性比率；CI為一致性指標(biāo)；RI為平均隨機(jī)一致性指標(biāo)。經(jīng)計(jì)算，CR=0.0056<0.1，判定該矩陣符合一致性檢驗(yàn)，所得權(quán)重系數(shù)有效[8]。

2.3.2 CRITIC法

CRITIC(指標(biāo)重復(fù)性相關(guān))法是客觀權(quán)重賦權(quán)法，綜合了指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度和沖突性兩種權(quán)重[9]。對(duì)比強(qiáng)度使用標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行衡量，標(biāo)準(zhǔn)差越大則權(quán)重越大；沖突性使用指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行衡量，指標(biāo)之間相關(guān)性越強(qiáng)則沖突性較低，權(quán)重越??；綜合權(quán)重為指標(biāo)變異性與沖突性指標(biāo)之間的乘積；最終權(quán)重是由綜合權(quán)重進(jìn)行歸一化計(jì)算得到。常用于多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)中。

利用SPSS 21.0軟件，將表1中的數(shù)據(jù)按式(2)進(jìn)行線性插值處理，消除單位量綱并計(jì)算指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度(si)、沖突性(δi)、綜合權(quán)重(ci)、權(quán)重系數(shù)(ωi)[10]，結(jié)果見表3。

(2)

表3 CRITIC法權(quán)重系數(shù)計(jì)算結(jié)果

由表3可知，采用CRITIC法計(jì)算得到鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率、王不留行黃酮苷轉(zhuǎn)移率、毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率、醇浸膏得率等4 個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為0.332 1、0.307 1、0.150 0、0.210 8。

2.3.3 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法

AHP法量化了4個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的重要程度并進(jìn)行兩兩比較，體現(xiàn)了中藥復(fù)方“君臣佐使”的特點(diǎn)，得到了以主觀信息為基礎(chǔ)的權(quán)重系數(shù)[7]；CRITIC法計(jì)算得到的權(quán)重系數(shù)更加客觀[11]。將主、客觀結(jié)合起來，按式(3)計(jì)算綜合權(quán)重系數(shù)(ω綜合ij)：

(3)

式中：ωAHPij為AHP法計(jì)算的權(quán)重系數(shù)；ωCRITICij為CRITIC法計(jì)算的權(quán)重系數(shù)；i為第i個(gè)因素；j為第j個(gè)樣本。

采用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法計(jì)算得到鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率、王不留行黃酮苷轉(zhuǎn)移率、毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率、醇浸膏得率等4個(gè)指標(biāo)的綜合權(quán)重系數(shù)分別為0.560 3、0.291 9、0.082 6、0.065 1。

2.3.4 3種權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法的比較

分別按3種方法計(jì)算權(quán)重系數(shù)，對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。

表4 3種權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法評(píng)價(jià)結(jié)果的比較

由表4可知，3 種權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法所得到的綜合評(píng)分差異較小。參考綜合評(píng)分，采用SPSS 21.0軟件對(duì)3種權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法進(jìn)行相關(guān)性處理，可得AHP 法與CRITIC 法之間顯著相關(guān)(R=0.990，P<0.01)；AHP-CRITIC混合加權(quán)法與AHP法、CRITIC 法之間顯著相關(guān)，其R分別為0.996(P<0.01)和0.974(P<0.01)。說明AHP 法、CRITIC 法及AHP-CRITIC混合加權(quán)法具有一致性的評(píng)分結(jié)果。參考權(quán)重系數(shù)，對(duì) AHP法與 CRITIC法進(jìn)行相關(guān)性處理，結(jié)果顯示，其相關(guān)性不顯著(R=0.819，P>0.05)，所反映的信息不具疊加性。綜合分析可得，AHP-CRITIC 混合加權(quán)法兼顧主觀和客觀分析，結(jié)合了AHP法與CRITIC法的優(yōu)勢(shì)，綜合評(píng)分結(jié)果更為合理、可靠。

2.4 最佳醇提工藝[12]

采用AHP-CRITIC混合加權(quán)法計(jì)算權(quán)重系數(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，直觀分析與方差分析結(jié)果分別見表5、6。

由表5可知，對(duì)提取率影響最大的因素是A，影響最小的因素是B。由表6可知，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的因素是A和C。若考慮工業(yè)生產(chǎn)成本，綜合各因素對(duì)生產(chǎn)過程及結(jié)果的影響，確定前列爽顆粒的最佳醇提工藝為A2B2C3，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶10 (g∶mL)、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)2次。

表5 直觀分析

表6 方差分析

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按處方量稱取關(guān)黃柏、王不留行(炒)、車前子，在最佳工藝條件下進(jìn)行醇提，測(cè)定鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率、王不留行黃酮苷轉(zhuǎn)移率、毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率和醇浸膏得率，結(jié)果見表7。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，綜合評(píng)分的RSD<2.0%。表明優(yōu)選工藝穩(wěn)定、合理，可用于前列爽顆粒的醇提。

2.6 討論

(1)在進(jìn)行HPLC含量測(cè)定時(shí)，本研究首先考慮采用相同色譜條件同時(shí)測(cè)定3種成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種藥材成分相互之間干擾較大，色譜峰分離差，未能較好地分離樣品，故仍參照《中華人民共和國藥典》(一部)2015年版中3種藥材含量測(cè)定方法選擇色譜條件分別測(cè)定鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷。

(2)車前子中毛蕊花糖苷對(duì)腎臟有保護(hù)作用，具有減少腎蛋白及抑制腎纖維化的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷在提取液中極易降解，與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致。故將提取液快速濃縮后制成固體顆粒，從而抑制了毛蕊花糖苷的降解。

(3)中藥復(fù)方制劑成分相對(duì)比較復(fù)雜，采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)已經(jīng)成為現(xiàn)代研究中藥復(fù)方制劑的重要方法之一[15]，AHP-CRITIC混合加權(quán)法融合主觀和客觀兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，比單一賦權(quán)法更科學(xué)，合理性更強(qiáng)[16]。本研究將多指標(biāo)權(quán)重分析和單因素-正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合，既驗(yàn)證了單因素-正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)避免了因自定義權(quán)重造成的研究結(jié)果的主觀性，將兩者結(jié)合，得到的研究結(jié)論更加客觀和全面。

3 結(jié)論

結(jié)合中藥復(fù)方提取工藝的特點(diǎn)和實(shí)際情況，采用AHP-CRITIC混合加權(quán)法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)得到前列爽顆粒的最佳醇提工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶10 (g∶mL)、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)2次，在此條件下，鹽酸小檗堿、王不留行黃酮苷、毛蕊花糖苷的平均轉(zhuǎn)移率分別為81.57%、64.49%、88.15%，醇浸膏平均得率為39.38%，平均綜合評(píng)分為97.67(RSD=1.98%，n=3)。該提取工藝重復(fù)性好、穩(wěn)定可行，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。