段濰超，楊澤群，劉其友

(1.青島歐賽斯環(huán)境與安全技術(shù)有限責(zé)任公司，山東 青島 266555； 2.中國(guó)石油大學(xué)(華東)，山東 青島 266555)

石油是目前人類使用最為廣泛的能源之一，但在開采、儲(chǔ)運(yùn)、煉制及加工過(guò)程中，石油因事故、泄漏或排污等不可避免的會(huì)進(jìn)入水體和土壤中，從而污染生態(tài)環(huán)境[1-3]。相較于物理法和化學(xué)法，微生物法可將烴類物質(zhì)礦化成H2O、CO2及其它無(wú)毒物質(zhì)，且由于投資少和能耗低等優(yōu)勢(shì)，已成為石油污染修復(fù)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[4]。自然界中廣泛存在著許多能夠降解石油的微生物[5]。謝丹平等[6]分離得到了可降解C12～C22直鏈烷烴的芽孢桿菌屬菌株和鄰單胞菌屬菌株；李寶明等[7]成功篩選到1株高效降解芳香烴的蒼白桿菌屬菌株和2株高效降解直鏈烷烴的紅球菌屬菌株；Roy等[8]則分離到5株對(duì)阿拉伯混合原油降解率達(dá)47%～78%的石油降解菌。隨著篩選技術(shù)的發(fā)展，石油烴高效降解菌會(huì)不斷被篩選出，但在大多數(shù)情況下，單一菌株對(duì)石油烴的降解能力仍然有限，若通過(guò)構(gòu)建復(fù)配菌群、利用微生物間的協(xié)同作用，可極大提高微生物降解石油烴的能力。謝丹平[9]通過(guò)復(fù)配實(shí)驗(yàn)確定了4種石油烴高效降解菌株的最優(yōu)菌液接種量；張秀霞等[10]研究了復(fù)配微生物降解石油烴的最優(yōu)pH值和接種量；馬強(qiáng)[11]研究了復(fù)配微生物降解石油烴的最優(yōu)pH值和溫度。

作者基于原油組成選取模式物，從實(shí)驗(yàn)室保存的石油烴降解菌株中篩選各模式物的高效降解菌株，并對(duì)高效降解菌株的復(fù)配進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定復(fù)配菌群的最優(yōu)降解條件。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與儀器

菌株S1、S2、S3、S4、S5和S6，實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。

BCM-1000型生物凈化工作臺(tái)，凈化設(shè)備有限公司；LDZM型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-QX型全溫振蕩器、HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；GILSON型移液槍，上海華運(yùn)分析儀器有限公司；Scout Pro型分析天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；UV-2100型紫外分光光度計(jì)，上海昂拉儀器有限公司；KDN-08C型消化爐、ATN-300型全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.2 菌株活化和篩選

菌株活化：在250 mL錐形瓶中，配制100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g或5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，NaCl 5 g，pH值7.0～7.2)，經(jīng)立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，冷卻至室溫；接種2 mL原始菌液至培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器，30 ℃、160 r·min-1持續(xù)振蕩48 h。

菌株篩選：在250 mL錐形瓶中，配制100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基[(NH4)2SO41.0 g，K2HPO41.0 g，CaCl20.02 g，NaCl 10 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eCl3痕量，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0]，經(jīng)立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，冷卻至室溫后置于生物凈化工作臺(tái)上，分別加入一定量的甲苯(1 mL)、菲(0.2 g)、石蠟(3 g)和原油(0.1 g)；無(wú)菌操作取出已活化菌株S1、S2、S3、S4、S5和S6，各接種2 mL菌液至培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器，30 ℃、160 r·min-1持續(xù)振蕩5 d。

1.3 降解率的測(cè)定

將模式物甲苯、菲和原油分別溶于一定量的石油醚中，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別取一系列不同量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用石油醚定容，得到不同梯度濃度的模式物溶液；用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光度(甲苯、菲和原油的最大吸收波長(zhǎng)分別為242 nm、211 nm和225 nm)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(表1)進(jìn)行濃度標(biāo)定，分別計(jì)算甲苯、菲和原油的降解率。

表1 甲苯、菲和原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

模式物石蠟的質(zhì)量標(biāo)定采用稱重法：將降解后含固體石蠟的搖瓶從恒溫振蕩器中取出，將培養(yǎng)液過(guò)濾后風(fēng)干，稱重并記錄剩余石蠟質(zhì)量，按下式計(jì)算石蠟降解率(D，%)：

式中：M為降解前石蠟質(zhì)量，g；M0為降解后石蠟質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴高效降解菌株的篩選

2.1.1 單一菌株對(duì)甲苯、菲、石蠟的降解率

菌株S1～S6對(duì)模式物甲苯、菲和石蠟的降解率如圖1所示。

由圖1可知，對(duì)于模式物甲苯，菌株S2和S5的降解率最高，分別達(dá)到了44.44%和39.23%，可參與后期菌株復(fù)配；對(duì)于模式物菲，菌株S1和S6的降解率最高，分別達(dá)到了41.80%和39.68%，可參與后期菌株復(fù)配；對(duì)于模式物石蠟，菌株S1～S6的降解率均不超過(guò)5%，其中S4對(duì)石蠟的降解率最高(4.41%)，可參與后期菌株復(fù)配。

圖1 菌株S1～S6對(duì)模式物甲苯、菲和石蠟的降解率Fig.1 Degradation rate of toluene,phenanthrene,and paraffin wax by strains S1-S6

2.1.2 單一菌株對(duì)原油的降解率

菌株S1～S6對(duì)原油的降解率如圖2所示。

圖2 菌株S1～S6對(duì)原油的降解率Fig.2 Degradation rate of crude oil by strains S1-S6

由圖2可知，菌株S1～S6對(duì)原油的降解率均不超過(guò)20%，分別為18.50%、12.44%、12.66%、10.55%、12.58%、10.50%。除菌株S1略高外，菌株S2～S6對(duì)原油的降解率相差不大。

2.2 石油烴高效降解菌株的復(fù)配

基于單一菌株對(duì)模式物的降解率，選擇菌株S1、S2、S4、S5、S6經(jīng)不同方式組合得到石油烴高效降解菌株復(fù)配菌群A、B、C、D(表2)。將4種復(fù)配菌群分別接種至含原油的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，5 d后，測(cè)定4種復(fù)配菌群對(duì)原油的降解率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，復(fù)配菌群A、B、C、D對(duì)原油的降解率分別為28.74%、21.71%、22.47%、24.26%，明顯高于單一菌株對(duì)原油的降解率。其中，復(fù)配菌群A(S1+S2+S4)對(duì)原油的降解率最高，這是因?yàn)?種單一菌株S1、S2、S4分別對(duì)多環(huán)芳烴、單環(huán)芳烴、長(zhǎng)鏈烷烴具有較好的降解效果，復(fù)配后，通過(guò)協(xié)同作用可以獲得更高的原油降解率。因此，選取復(fù)配菌群A 進(jìn)行后續(xù)的降解條件優(yōu)化研究。

表2 4種復(fù)配菌群的組成

圖3 4種復(fù)配菌群對(duì)原油的降解率Fig.3 Degradation rate of crude oil by four compound bacteria

2.3 復(fù)配菌群A對(duì)原油的降解條件優(yōu)化

選擇pH值、底物濃度、氮磷比、接種量和溫度為考察因素，以原油降解率為指標(biāo)，采用5因素5水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配菌群A對(duì)原油的降解條件，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，在25組實(shí)驗(yàn)中，復(fù)配菌群A對(duì)原油的降解率最高可達(dá)37.52%(12#實(shí)驗(yàn))，相應(yīng)的降解條件為：pH值7、底物濃度0.4 g·L-1、氮磷比7∶1、接種量1 mL、溫度30 ℃；5種因素對(duì)原油降解率的影響大小為：pH值>溫度>底物濃度>接種量>氮磷比，其中pH值對(duì)原油降解率的影響最大，溫度次之，氮磷比影響最小，這可能是由于復(fù)配菌群A內(nèi)的原油分解酶對(duì)pH值較為敏感所致。

3 結(jié)論

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的6株石油烴降解菌S1～S6進(jìn)行活化，然后以甲苯、菲、石蠟為模式物，考察單一菌株對(duì)模式物的降解效果，發(fā)現(xiàn)對(duì)單環(huán)芳烴(甲苯)降解效果最好的是S2和S5，對(duì)多環(huán)芳烴(菲)降解效果最好的是S1和S6，對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴(石蠟)降解效果最好的是S4。將S1、S2、S4復(fù)配得到的復(fù)配菌群對(duì)原油的降解效果最好，其最優(yōu)降解條件為：pH值7、底物濃度0.4 g·L-1、氮磷比7∶1、接種量1 mL、溫度30 ℃，各因素對(duì)原油降解率的影響大小為：pH值>溫度>底物濃度>接種量>氮磷比。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析