徐玉順 鄭 丹 宋 偉

動脈粥樣硬化是一種動脈壁慢性炎性疾病，由免疫細胞的侵入、增殖和激活驅動和維持，巨噬細胞在其中發(fā)揮著至關重要的作用[1]。巨噬細胞的活化分為經典激活（M1）型和交替活化（M2）型，M2 型巨噬細胞在人類和小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展中起預防作用[2]。在白介素4（IL-4）刺激下，巨噬細胞發(fā)生M2 型活化，抵抗氧化修飾低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取以及轉變?yōu)榕菽毎M而減小噬斑大小和增強噬斑穩(wěn)定性[3]。然而M2 型巨噬細胞活化機制尚不明確。樹突狀細胞相關凝集素-2（Dectin-2）是C 型凝集素受體家族成員，此前研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2 在固有巨噬細胞（稱為Kupffer 細胞）中發(fā)揮功能，以介導癌細胞的攝取和清除[4]。研究表明，敲除造血細胞Dectin-2 可以明顯降低動脈粥樣硬化區(qū)域炎癥反應，提示Dectin-2 可能參與調控巨噬細胞炎癥反應[5]。然而Dectin-2 對M2 型巨噬細胞的具體作用以及調控機制尚不明確，基于此，本研究將探討Dectin-2 對M2型巨噬細胞活化的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 C57BL/6 小鼠（6～8 周齡，雄性，SPF級）購自維亞生物科技（上海）有限公司，使用許可證號：SYXK（滬）2020-0001。

1.2 試 劑 巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）（批號121357）購自賽業(yè)生物科技有限公司；胎牛血清（批號12484010）、DMEM/F12（批號11320033）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；鼠IL-4 因子（批號PRP100498）購自艾美捷科技有限公司；紅細胞裂解液（批號155246）購自上海碧云天生物技術有限公司；RNA 逆轉錄試劑盒（批號QP056）及熒光定量PCR 試劑盒（批號QP076）均購自廣州易錦生物技術有限公司；細胞凋亡測定試劑盒（批號23185）購自美國Invitrogen Life Technologies Inc.，Carlsbad，CA；兔單抗Dectin-2（批號ab107572）購自艾博抗（上海）貿易有限公司；兔單抗信號傳導及轉錄激活蛋白6（STAT6）（批號5397）、兔單抗磷酸化信號傳導及轉錄激活蛋白6（p-STAT6）（批號56554）、山羊抗兔Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗（批號265121）均購自賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器 CFX96 Touch 熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)[BIO-RAD 儀，伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司]；FACSAriaTMⅢ流式細胞儀（美國BD 公司）；酶標儀SpectraMax 5 [美谷分子儀器（上海）有限公司]HerasafeTM2030i Biological Safety Cabinets 生物安全柜（美國賽默飛公司）；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR 公司）；VE 680 微型垂直電泳設備（上海天能科技有限公司）；-80℃超低溫冰箱（美國賽默飛公司）；CelMate 二氧化碳培養(yǎng)箱（Esco Lifesciences，新加坡藝思高科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 骨髓來源巨噬（BMDM）的分離和培養(yǎng) 小鼠采用椎脫臼處死后，利用75%酒精消毒，取小鼠后肢股骨，用1mL 注射器吸取含有1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基插入股骨處反復沖洗，收集沖洗液離心沉降細胞。加入紅細胞裂解液破紅后再次離心，750rpm 離心5min，加入含巨噬細胞M-CSF 的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加50U/mL 青霉素和鏈霉素。7 天后即可得到成熟的骨髓來源巨噬細胞。為敲降巨噬細胞Dectin-2，細胞鋪板后轉染siDectin-2 或及其對照siNC，6h 后換液，24h 檢測敲降效率。對于M2 極化，BMDM 用IL-4（20ng/mL）處理24h 即可檢測M2 極化標志物，對照組加入等體積PBS。

2.2 熒光定量PCR 巨噬細胞經上述IL-4 刺激后，利用trizol 法提取RNA，逆轉為cDNA。RT-PCR 引物均購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司，引物序列如下：GAPDH：上游引物5'-TGGATTTGGACGCATTGGTC-3'；下游引物5'-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3'；Dectin-2：上游引物5'-AAGCGGAGCAGAATTTCATCA-3’；下游引物5'-CCATTTGCCATTACCTTGTGGA-3'；Arg1：上游引物5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3'；下游引物5'-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3'；Ym1：上游引物5'-TCTCTACTCCTCAGAACCGTCAGA-3'；下游引物5'-ATGTTTGTCCTTAGGAGGGCTTC-3'；FIZZ1：上游引物5'-TACTTGCAACTGCCTGTGCTTACT-3'；下游引物5'-TATCAAAGCTGGGTTCTCCACCTC-3'。RT-PCR 程序為：94℃，2min 預變形；98℃，10s 變性；60℃，30s 退火；72℃，30s 延伸；循環(huán)數(shù)：35 個。

2.3 細胞免疫熒光 巨噬細胞鋪板于細胞爬片上，經上述步驟加入IL-4 刺激后，取出經4%PAF 固定，0.5% triton 破膜后，利用5% BSA 封閉液封閉，兔單抗Dectin-2（稀釋于5%BSA 中，稀釋比1:200）4℃孵育過夜。PBS 洗去一抗后室溫孵育山羊抗兔Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗（稀釋于5%BSA 中，稀釋比1:400）1h。利用DAPI 室溫孵育10min 標記細胞核。通過Nikon A1R 共聚焦顯微鏡成像分析。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將siDectin-2 或及其對照siNC 轉染的巨噬細胞（1.5×105/孔）鋪板并與ox-LDL 孵育24h，然后在收集前用胰蛋白酶消化。通過膜聯(lián)蛋白V/PI 雙重染色，通過細胞凋亡測定試劑盒確定凋亡細胞。流式細胞儀分析染色的細胞。

2.5 蛋白免疫印跡（WB）法檢測STAT6 磷酸化 將siDectin-2 或及其對照siNC 轉染的巨噬細胞（1.5×105/孔）鋪板并加入IL-4（20ng/mL）刺激24h。收集細胞蛋白后進行SDS-PAGE 電泳。4℃過夜孵育一抗（抗體稀釋比均為1:1000），熒光二抗室溫孵育1h。掃膜儀進行顯影。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 IL-4 刺激促進巨噬細胞Dectin-2 表達 利用IL-4 刺激BMDM 24h 后檢測Dectin-2 表達，結果顯示，IL-4 在10、20ng/mL 的濃度下均促進Dectin-2 的表達（見表1），同時IL-4（20ng/mL）刺激巨噬細胞后，通過細胞免疫熒光法檢測也觀察到Dectin-2 在巨噬細胞中表達升高，見插頁圖1。

圖1 IL-4 刺激巨噬細胞Dectin-2 表達上調（免疫熒光X800）

表1 各組Dectin-2 mRNA 相對表達量（）

表1 各組Dectin-2 mRNA 相對表達量（）

注：對照組為巨噬細胞加入PBS 培養(yǎng)24h；IL-4（10ng/mL）組為巨噬細胞加入10ng/mL IL-4 培養(yǎng)24h；IL-4（20ng/mL）組為巨噬細胞加入20ng/mL IL-4 培養(yǎng)24h；Dectin-2 為樹突狀細胞相關凝集素-2；IL-4為白介素4；與對照組比較，aP＜0.05

3.2 Dectin-2 缺失抑制M2 型巨噬細胞活化 通過siRNA 敲降BMDM 中Dectin-2 后，利用IL-4（20ng/mL）刺激24h 檢測巨噬細胞M2 型活化標志物，結果顯示，與IL-4+siNC 組相比，IL-4+siDectin-2 組中巨噬細胞M2 型標志物精氨酸酶1（Arg1）、抵抗素樣分子α（FIZZ1）、幾丁質酶3（Ym1）的表達均明顯下調（P＜0.05）。見表2。

表2 各組Arg1、FIZZ1、Ym1 mRNA 相對表達量（）

表2 各組Arg1、FIZZ1、Ym1 mRNA 相對表達量（）

注：siNC 組為巨噬細胞轉染siNC 24h 加入PBS 培養(yǎng)24h；siDectin-2組為巨噬細胞轉染siDectin-2 敲降Dectin-2 加入PBS 培養(yǎng)24h；IL-4+siNC 組為巨噬細胞轉染siNC 24h 后加入IL-4（20ng/mL）刺激24h；IL-4+siDectin-2 組為巨噬細胞轉染siDectin-2 24h 后加入IL-4（20ng/mL）刺激24h；Dectin-2 為樹突狀細胞相關凝集素-2；Arg1 為精氨酸酶1；FIZZ1 為抵抗素樣分子α；Ym1 為幾丁質酶3；與siNC 組比較，aP＜0.05；與IL-4+siNC 組相比，bP＜0.05

3.3 Dectin-2 敲降抑制ox-LDL 誘導的巨噬細胞凋亡 通過siRNA 敲降BMDM 中Dectin-2 后，加入ox-LDL 促進巨噬細胞吞脂質并誘導凋亡。流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 敲降可以明顯抑制ox-LDL 誘導的巨噬細胞凋亡的產生。ox-LDL+siNC 組凋亡率為（30.04±0.62）%；ox-LDL+siDectin-2 組凋亡率為（12.36±1.07）%。見插頁圖2。

圖2 Dectin-2 敲降抑制ox-LDL 誘導的巨噬細胞凋亡

3.4 Dectin-2 敲降抑制STAT6 磷酸化 通過siRNA敲降BMDM 中Dectin-2 后，利用IL-4（20ng/mL）分別刺激0、5、30、60min 檢測巨噬細胞STAT6 磷酸化水平，WB 檢測結果顯示，Dectin-2 敲降明顯抑制STAT6 磷酸化激活。見圖3。

4 討論

動脈粥樣硬化過程中巨噬細胞的極化及其對脂質的吞噬是導致泡沫細胞形成及動脈斑塊不穩(wěn)定的重要原因之一。巨噬細胞進入斑塊后發(fā)生極化，分泌多種分泌促炎和抗炎的細胞因子，從而影響斑塊穩(wěn)定性[6]。前期研究表明，增加斑塊組織中M2 型抗炎巨噬細胞的比例，可以減輕斑塊局部的炎性反應，增加斑塊組織的穩(wěn)定性，而M1 型促炎巨噬細胞則大量存在于不穩(wěn)定斑塊中[7]。因此解析動粥斑塊中巨噬細胞極化的分子調控機制成為進一步了解動粥斑塊穩(wěn)定的關鍵。

圖3 Dectin-2 敲降抑制STAT6 磷酸化

Thiem 等[5]將造血細胞中Dectin-2 敲除后，通過骨髓置換手術到Ldlr-/-轉基因小鼠中，再通過高脂喂養(yǎng)構建動脈粥樣硬化模型，結果發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 缺失后明顯減輕動粥病灶部位炎癥反應，Ly6C 陽性的單核細胞明顯減少，同時LPS 刺激后，小鼠腹膜巨噬細胞明顯減少，提示Dectin-2 在調控巨噬細胞功能過程可能發(fā)揮著重要的作用。本研究結果顯示，巨噬細胞Dectin-2 在IL-4 誘導后表達明顯升高，敲降Dectin-2 抑制巨噬細胞M2 型活化。同時利用誘導動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵脂質分子ox-LDL 刺激巨噬細胞發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 敲降明顯抑制細胞凋亡。因此我們推測Dectin-2 在動脈粥樣硬化過程起到保護作用。

目前關于Dectin-2 調控其他免疫細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 通過其跨膜結構域與包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM）的信號傳導銜接子FcRγ 結合，并可以招募B 細胞內Syk，從而激活其下游CARD9/NF-κB 途徑[5，8-11]。而M2 型巨噬細胞的活化主要依賴于STAT6 的磷酸化激活[12-13]，因此本研究探究了Dectin-2 對STAT6 活化的影響，結果發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 敲降能夠明顯抑制IL-4 刺激誘導的STAT6 磷酸化，從而抑制M2 極化標志物的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在炎癥因子IL-4 刺激下，巨噬細胞Dectin-2 表達上調，敲降Dectin-2 可以抑制IL-4 誘導的M2 型巨噬細胞活化以及ox-LDL 誘導的細胞凋亡，其作用機制可能是通過調控STAT6 磷酸化水平。