耿輝，田國祥，王亞軍，張勇，馬茂，呂軍

腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在癌癥患者的治療效果和預(yù)后扮演著重要角色[1-3]，但腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞常存在動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，其過程十分復(fù)雜，使臨床研究充滿困難[4,5]。高通量測(cè)序技術(shù)分析mRNA差異表達(dá)是成熟的腫瘤細(xì)胞生物信息學(xué)研究方法，被廣泛應(yīng)用于研究多種癌癥類型的轉(zhuǎn)錄組分析中，但其分析結(jié)果不能直接表明免疫細(xì)胞的組成，需要通過一系列算法評(píng)估免疫浸潤(rùn)，主要方法有兩種：ssGSEA法及反卷積法。ssGSEA法，目的是得到每個(gè)樣本的免疫細(xì)胞或免疫功能，免疫通路的活性，根據(jù)免疫活性進(jìn)行分組，繼而進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；反卷積法，目的是從大量已知細(xì)胞樣本的表達(dá)水平推測(cè)不同樣本某類型細(xì)胞的表達(dá)值[6,7]。

TIME2.0網(wǎng)站綜合以上系列算法對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫或使用者自己提交的腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)估算特定免疫細(xì)胞類型，通過復(fù)雜的計(jì)算方法綜合評(píng)估免疫浸潤(rùn)結(jié)果更具可靠性，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2019年學(xué)者Chaoran等通過腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞分析平臺(tái)TIMER分析了所有腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（TIIC）與NDRG家族之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NDRG2和NDRG3的mRNA高表達(dá)與肝癌發(fā)生相關(guān)[8]。2019年學(xué)者Hao等運(yùn)用TIMER平臺(tái)分析出EGFRMUT和EGFR-WT病例免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平差異，從而得到EGFR的突變表明特定類型免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)增加且使預(yù)后不良的結(jié)論[9]。2019年Liang等用TIMER估計(jì)候選基因在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和臨床參數(shù)之間的潛在關(guān)聯(lián)，通過Spearman相關(guān)法計(jì)算EMT基因與腫瘤微環(huán)境狀態(tài)之間的相關(guān)性，并在TIMER中進(jìn)行了驗(yàn)證[10]。2019年Liyan Chen Te通過TIMER評(píng)估CTRP1表達(dá)與GBM中腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞以及GBM中CTRP1和CCL2之間的mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性[11]。2019年Tu等學(xué)者用TIMER平臺(tái)分析評(píng)估來自TCGA的10897種32種癌癥類型的樣本數(shù)據(jù)中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，研究了免疫檢查點(diǎn)分子與典型浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性[12]。2019年學(xué)者Cai等利用TIMER平臺(tái)分析和比較了BTN3A2在32種癌癥的癌癥中的mRNA表達(dá)水平后得到結(jié)果，BTN3A2與預(yù)后結(jié)果呈正相關(guān)，可用作臨床預(yù)后效果的獨(dú)立診斷基因[13]。2019年學(xué)者Xiao等利用TIMER平臺(tái)評(píng)估TGFβ2的表達(dá)，探索TGFβ2與腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，確定TGFβ2可以作為胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物[14]。2019年學(xué)者Feng等利用TIMER數(shù)據(jù)平臺(tái)分析了miRNA差異表達(dá)與MIBC存活之間的相關(guān)性，共檢測(cè)到8個(gè)與MIBC的存活率相關(guān)miRNA[15]。2019年Xu等利用TIMER數(shù)據(jù)平臺(tái)探索CSF2表達(dá)與預(yù)后和免疫應(yīng)答之間的相關(guān)性，得到一種新型的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物[16]。

1 TIME2.0數(shù)據(jù)庫簡(jiǎn)介（使用流程）

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫能系統(tǒng)評(píng)估各種癌癥類型免疫浸潤(rùn)的綜合數(shù)據(jù)庫，提供多種方法評(píng)估免疫浸潤(rùn)程度，允許科研人員在線動(dòng)態(tài)生成高質(zhì)量的圖形，以全面探索多種腫瘤的免疫組學(xué)、臨床表現(xiàn)和基因組學(xué)特征。數(shù)據(jù)庫使用流程如圖1所示，登錄TIMER2.0數(shù)據(jù)庫（http://timer.cis-trome.org/），用鼠標(biāo)選擇評(píng)估方法、關(guān)注的腫瘤類型、目標(biāo)基因即可算出免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)據(jù)，并提供一鍵在線可視化。

圖1 TIMER2.0數(shù)據(jù)庫使用流程

2 TIME2.0數(shù)據(jù)庫主要模塊應(yīng)用介紹

TIME2.0數(shù)據(jù)庫主要有三個(gè)子模塊：Immune子模塊能夠分析目標(biāo)基因在腫瘤組織與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性；Exploration子模塊展示了目標(biāo)基因在腫瘤與正常組織之間的差異化表達(dá)；Estimation模塊允許科研人員上傳自己的數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫浸潤(rùn)情況評(píng)估。

2.1 Immune子模塊應(yīng)用介紹Immune子模塊下共有四個(gè)可供選擇的分支模塊，包括：Gene、Mutation、sCNA和Outcome。

Gene模塊允許科研人員自主選擇目標(biāo)基因，分析其表達(dá)量與多種癌癥類型中免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。用戶在“Gene Expression”和“Immune Infiltrates”下拉選框分別選擇目標(biāo)基因及免疫細(xì)胞后，點(diǎn)擊“Submit”按鈕后，將生成一張帶有數(shù)字的熱圖，該熱圖反映了各種癌癥類型中目標(biāo)基因表達(dá)量與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)系數(shù)，單擊單元格時(shí)，將彈出一個(gè)散點(diǎn)圖，以顯示浸潤(rùn)估計(jì)值與基因表達(dá)量之間的關(guān)系如圖3所示。

圖2 TIMER2.0數(shù)據(jù)庫主頁示意圖

圖3 Gene子模塊示意圖

Mutation模塊能夠同時(shí)分析和可視化基因突變對(duì)多種癌癥類型和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，科研人員通過手動(dòng)鍵入基因名稱或按突變頻率排序的常見突變基因列表選擇基因，然后指定免疫細(xì)胞類型并單擊提交，TIMER2.0會(huì)生成一個(gè)熱圖，該熱圖表是輸入基因突變與沒有突變的腫瘤組織之間的免疫浸潤(rùn)水平變化，單擊熱圖上的數(shù)據(jù)框，可查看突變與腫瘤組織中免疫浸潤(rùn)分布的小提琴圖。

sCNA模塊用來分析免疫浸潤(rùn)與體細(xì)胞拷貝數(shù)之間的關(guān)系。對(duì)于給定的基因，TIMER2.0將顯示一個(gè)堆積的條形圖，顯示所有TCGA癌癥類型改基因不同sCNA狀態(tài)的比例圖， TIMER2.0要求科研人員指定基因的“Deep Deletion”或“High Amplification”的狀態(tài)，以與“diploid/normal”狀態(tài)進(jìn)行比較，查詢完成時(shí)，TIMER2.0會(huì)繪制一個(gè)熱圖，以顯示拷貝數(shù)變更組和正常組之間免疫滲透水平變化。通過單擊每個(gè)表格，會(huì)通過小提琴圖顯示該基因在不同sCNA狀態(tài)之間的免疫滲透分布，以及正常組與每個(gè)變更組的對(duì)比如圖4所示。

圖4 sCNA子模塊示意圖

Outcome模塊用來分析免疫浸潤(rùn)與臨床樣本之間的相關(guān)性，同時(shí)建立一個(gè)COX風(fēng)險(xiǎn)模型，協(xié)變量可以是臨床因素或基因，選定變量并運(yùn)行后，TIMER數(shù)據(jù)庫會(huì)生成一個(gè)熱圖，顯示每個(gè)模型的多種癌癥類型浸潤(rùn)系數(shù)，熱圖的每個(gè)單元對(duì)應(yīng)于一個(gè)獨(dú)立的Cox模型，單擊該單元格將顯示相應(yīng)免疫浸潤(rùn)和癌癥類型的Kaplan-Meier曲線，Cox模型的危險(xiǎn)比和P值及KM曲線的對(duì)數(shù)P值將顯示在KM曲線圖上，點(diǎn)擊按鈕“JPG”或“PDF”會(huì)以jpg或pdf格式下載如圖5所示圖片。

2.2 Exploration模塊應(yīng)用簡(jiǎn)介Exploration子模塊下有四個(gè)可供選擇的分支模塊，包括：Gene_DE、Gene_Outcome、Gene_Mutation和Gene_Corr。

圖5 Immune模塊的COX風(fēng)險(xiǎn)模型示意圖

Gene_DE模塊研究TCGA腫瘤中目標(biāo)基因與鄰近正常組織之間的差異表達(dá)，通過差值分析（edgeR）計(jì)算轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，用星號(hào)標(biāo)注統(tǒng)計(jì)顯著性（*：P值＜0.05；**：P值＜0.01；***：P值＜0.001 ），如圖6所示。

圖6 Exploration模塊泛癌結(jié)果示意圖

Gene_Outcome模塊分析基因表達(dá)與臨床樣本之間的相關(guān)性，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估基因表達(dá)結(jié)果顯著性，可選擇不同臨床因素調(diào)整模型結(jié)果，結(jié)果通過繪制熱圖顯示Cox模型中基因的歸一化系數(shù)，單擊如圖中的單元格，會(huì)展示每個(gè)COX模型的KM曲線。

Gene_Mutation模塊分析比較不同突變狀態(tài)之間的差異基因表達(dá)，研究人員在線選擇突變基因后，點(diǎn)擊“Submit”按鈕提交，結(jié)果用熱圖展示每種癌癥類型的基因差異表達(dá)的log2倍數(shù)變化，單擊單元格將顯示詳細(xì)信息。

Gene_Corr模塊用于分析目標(biāo)基因與各種癌癥類型的基因列表之間的相關(guān)性，結(jié)果以熱圖展示基因之間的相關(guān)性。

2.3 Estimation模塊應(yīng)用簡(jiǎn)介Estimation模塊支持研究者上傳自己的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估。研究者進(jìn)入Estimation模塊后點(diǎn)擊“Browse”上傳自己的表達(dá)矩陣，可上傳csv和txt等常見格式，物種包含人類和小鼠，“Cancer Type”選項(xiàng)卡下拉選擇腫瘤類型，如選擇“AUTO”選項(xiàng)TIMER數(shù)據(jù)庫將自動(dòng)根據(jù)評(píng)估結(jié)果擬合契合度最高的TCGA癌癥類型，以上選擇完成后點(diǎn)擊“RUN !”運(yùn)行得到評(píng)估結(jié)果如圖7～9所示的一表兩圖。

圖7結(jié)果下方表格中列名為不同數(shù)據(jù)庫中的免疫細(xì)胞名稱，行名為樣本名，表格中的數(shù)據(jù)為各樣本的免疫細(xì)胞含量。

圖7 Esimation模塊結(jié)果表1

圖8的柱狀圖表示不同免疫細(xì)胞在不同數(shù)據(jù)庫對(duì)應(yīng)樣本中含量的統(tǒng)計(jì)圖，行名表示不同免疫細(xì)胞，列名為：TIMER、CIBERSORT、quanTIseq、xCell、MCPCounter、EPIC不同數(shù)據(jù)庫，圖中不同顏色的柱狀圖對(duì)應(yīng)不同的樣本，柱的高度表示該免疫細(xì)胞在對(duì)應(yīng)樣本中的含量。

圖8 Esimation模塊結(jié)果圖1

圖9的餅狀圖表示不同樣本間免疫細(xì)胞含量的統(tǒng)計(jì)圖，行名表示樣本，列名為：CIBERSORT、quanTIseq、EPIC數(shù)據(jù)庫，圖中不同顏色對(duì)應(yīng)不同的免疫細(xì)胞，扇形的面積表示該免疫細(xì)胞在對(duì)應(yīng)樣本中的含量。

3 討論

圖9 Esimation模塊結(jié)果圖2

TIMER2.0是一個(gè)免費(fèi)的交互式web服務(wù)數(shù)據(jù)庫，能夠全面、靈活地評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞并可視化，本文詳細(xì)介紹了該數(shù)據(jù)庫的使用方法，TIMER2.0數(shù)據(jù)庫主要有三個(gè)部分組成：Immune子模塊分析目標(biāo)基因在腫瘤組織與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性、Exploration子模塊展示目標(biāo)基因在腫瘤與正常組織之間的差異化表達(dá)、Estimation模塊允許進(jìn)行個(gè)性化的免疫浸潤(rùn)情況評(píng)估。三個(gè)子模塊均能將通過ssGSEA及反卷積算法評(píng)估的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果進(jìn)行可視化展示[17]。

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫集成了多種最新算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估，這些算法使科研人員能夠一站式探索癌癥基因組圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫中免疫細(xì)胞與腫瘤之間的各種相關(guān)性。TIMER2.0數(shù)據(jù)庫利用immunedeconv[18]R軟件包集成了包括TIMER、xCell、MCP、CIBERSORT、EPIC和quanTIseq等算法，TIMER是唯一一種在估計(jì)免疫細(xì)胞數(shù)量時(shí)會(huì)考慮組織特異性的方法，xCell算法納入了大量不同類型的免疫細(xì)胞，CIBERSORT算法對(duì)反卷積計(jì)算中更具某種特征的細(xì)胞子集進(jìn)行關(guān)注，EPIC和quanTIseq優(yōu)勢(shì)在于直接對(duì)輸入樣本對(duì)應(yīng)的測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，隨之展開免疫細(xì)胞組分預(yù)測(cè)，綜合使用以上算法對(duì)所有TCGA樣本進(jìn)行統(tǒng)一的預(yù)處理，會(huì)使研究人員得出評(píng)估的免疫浸潤(rùn)結(jié)果更加可靠，這些算法均通過了系統(tǒng)的基準(zhǔn)測(cè)試[17-19]。因?yàn)椴煌M織中各種癌細(xì)胞所處免疫環(huán)境不同[20-23]，故需運(yùn)用多種算法進(jìn)行綜合評(píng)估，才能使結(jié)果更具有可靠性，根據(jù)結(jié)果生成的熱圖中，紅色方框表示顯著正相關(guān)，藍(lán)色方框表示顯著負(fù)相關(guān)，灰色表示不相關(guān)，通過熱圖科研人員可直觀識(shí)別各種組織樣本之間的重要關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)不同癌癥類型之間的共同趨勢(shì)以及特定癌癥類型與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。

綜上所述，TIMER2.0數(shù)據(jù)庫對(duì)科研人員提供了友好軟件界面和人性化的可視化交互，最大限度方便科研人員進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)庫中的免疫浸潤(rùn)、基因表達(dá)、突變和生存特征之間的關(guān)聯(lián)，豐富了科研人員進(jìn)行腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的研究方法，節(jié)省了科研人員學(xué)習(xí)R語言及數(shù)據(jù)預(yù)處理時(shí)間，并且隨著生物信息技術(shù)的蓬勃發(fā)展，毫無疑問，未來的TIMER2.0數(shù)據(jù)庫將納入更多的腫瘤信息數(shù)據(jù)庫使自身更加完善。