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        幽門螺桿菌生物膜的形成 致病性及其耐藥性

        2020-12-20 10:28:43周杰挺谷海瀛
        浙江臨床醫(yī)學 2020年2期
        關(guān)鍵詞:研究

        周杰挺 谷海瀛

        作者單位:315211 寧波大學醫(yī)學院

        幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種革蘭氏陰性,微需氧的人類病原體,目前已證實Hp感染與多種胃十二指腸慢性疾病密切相關(guān),包括慢性活動性胃炎,消化性潰瘍,萎縮性胃炎,黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌。據(jù)報道,世界上超過一半的人口受Hp感染,在發(fā)展中國家年齡>50歲的人群中Hp感染率高達80%[1],這給公眾健康帶來了巨大的負擔。自20世紀80年代發(fā)現(xiàn)Hp以來,對于Hp的研究主要集中在浮游態(tài)和非附著的生長方式上;然而,越來越多的證據(jù)表明Hp可以以一種被稱為生物膜的表面附著方式呈群落生長,這種生長模式有助于病原微生物在惡劣環(huán)境中的存活及抵抗抗生素的干預治療和宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng),從而延長感染時間,導致慢性感染[2]。目前,關(guān)于Hp生物膜的研究仍處于早期階段,其形成及其在致病中發(fā)揮的作用尚不明確,因此,本篇綜述將介紹近年來關(guān)于Hp生物膜形成相關(guān)分子機制及其生物膜致病作用的最新研究進展。

        1 胃部幽門螺桿菌生物膜的形成

        2006年,Carron等[3]使用掃描電子顯微鏡(SEM)首次觀察到致密成熟的Hp生物膜存在并附著于人胃黏膜活檢標本的上皮細胞上。近年來,Attaran B等[4]在小鼠模型中也證實了Hp生物膜的形成。他們使用SEM和多克隆抗Hp特異性免疫熒光抗體觀察到Hp在小鼠胃黏膜上形成了生物膜,表現(xiàn)出與在人類胃黏膜上一樣的潛力,由無定型細胞外基質(zhì)包裹的球形細菌牢固地附著在上皮細胞上。而且Cammarota等[5]報道,對于有≥4次Hp根除失敗病史的患者中,胃活檢標本的SEM分析顯示Hp在所有患者的胃黏膜上形成生物膜,并且當Hp被根除時,所有患者的生物膜都消失了。目前,尚不清楚體內(nèi)生物膜基質(zhì)是由細菌自己產(chǎn)生的,還是宿主衍生的基質(zhì)(例如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白)抑或兩者兼而有之。需要進一步的研究來確定宿主細胞對生物膜細胞外基質(zhì)的作用。Hp除了可在胃黏膜上皮細胞表面定植,還可以在胃腸道的腺體中定植[6]。這些腺體為Hp提供了一個良好的生長保護性環(huán)境。在Hp感染2~4周后,約有50%的腺體受到侵犯,達到平均25~40個細菌/腺體的腺體密度,在慢性感染中也有約10%的腺體受到侵犯。然而,在胃腺體中發(fā)現(xiàn)的Hp聚集體與生物膜中的生長方式相似,這可能是導致慢性感染的一個原因。因此,深入研究Hp生物膜生長方式在定植和持久性感染中的潛在作用是有必要的。

        2 幽門螺桿菌生物膜形成相關(guān)的分子機制

        觀察到Hp具有形成生物膜的能力至今已有20年了,近年來越來越多的研究開始聚焦于其生物膜形成的分子機制,多種方法學如蛋白質(zhì)組學、基因組學、轉(zhuǎn)錄組學被應(yīng)用于探索這種分子機制。

        Shao C等[7]通過模擬營養(yǎng)缺乏的生存壓力環(huán)境,誘導Hp生物膜的產(chǎn)生,通過高分辨率二維凝膠電泳獲得浮游態(tài)Hp和早期生物膜中Hp的蛋白質(zhì)組譜,隨后應(yīng)用串聯(lián)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionzation time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-TOF MS)鑒定兩者的差異蛋白質(zhì)斑點,最終鑒定出了35種與Hp早期生物膜形成關(guān)系密切的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與多種生物學功能相關(guān),包括鞭毛運動、細菌毒力、信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)。Feng-Ling Yang等[8]比較了第4天和第7天Hp生物膜的蛋白質(zhì)譜與第4天和第7天的浮游態(tài)培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)譜,發(fā)現(xiàn)中性粒細胞活化蛋白A(NapA)與其他9種壓力誘導的蛋白(包括60-kDa伴侶蛋白、過氧化氫酶、檸檬酸合成酶等)在生物膜中表達顯著增加,同時他們構(gòu)建了NapA缺失突變的菌株,觀察發(fā)現(xiàn)相比于同基因的野生型菌株,突變株的生物膜產(chǎn)生量減少且細菌聚集也明顯減少。

        在基因?qū)用?,目前研究發(fā)現(xiàn)與Hp生物膜形成可能相關(guān)的基因較多且復雜,Wong EH等[9]使用結(jié)晶紫法測定了32株(1株標準菌株和31株臨床菌株)Hp的生物膜產(chǎn)量,按照生物膜的量分為少量、中等和大量三個組,之后通過對32株菌株進行全基因組測序并將基因序列進行比較后發(fā)現(xiàn)三種假設(shè)基因K74_10375、K747_09130、K747_06625以及fucT、jhp_1117、homD 和cagA基因與生物膜形成的相關(guān)性最大。前三種基因的產(chǎn)物尚不明確,后四種基因編碼的產(chǎn)物分別為α-(1,3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、鞭毛蛋白、外膜蛋白和細胞毒素相關(guān)基因致病島(cagPAI)蛋白。從功能上來看,這些基因所編碼的產(chǎn)物在功能上與Shao C等研究發(fā)現(xiàn)的與Hp生物膜形成相關(guān)蛋白的功能類似。CagA基因的高表達似乎不難理解,因為普遍認為CagA 陽性的菌株致病力較強,這種較強的毒力可能與生物膜的形成存在聯(lián)系。而鞭毛在生物膜形成中的作用同樣值得重視,Wong等[9]在對Hp體外生物膜的研究中發(fā)現(xiàn)生物膜的形成依賴于鞭毛的作用,這與鞭毛能夠促進細菌聚集及參與外膜囊泡形成相關(guān)。另一項研究通過轉(zhuǎn)錄組學序列分析發(fā)現(xiàn),在Hp生物膜上調(diào)基因中包含了與鞭毛裝置形成有關(guān)的基因,進一步證實了鞭毛結(jié)構(gòu)在Hp生物膜形成中的關(guān)鍵作用。此外,這項研究還發(fā)現(xiàn)生物膜下調(diào)的基因主要是參與代謝和翻譯的基因,而與生物膜產(chǎn)量上調(diào)相關(guān)基因的產(chǎn)物主要在細胞膜上,主要是一些參與應(yīng)激反應(yīng)的基因。表明生物膜中細菌的代謝活性較低,且生物膜的形成是一種應(yīng)激反應(yīng)[11]。

        3 幽門螺桿菌生物膜與抗生素耐藥的相關(guān)性

        目前,對于Hp感染的一線治療,克拉霉素(clarithromycin,CAM)耐藥性是一個日益嚴重的問題,CAM抗性臨床菌株的分離率約為10%~30%。據(jù)報道,Hp 23S rRNA基因結(jié)構(gòu)域V環(huán)中的點突變是產(chǎn)生克拉霉素耐藥性的基礎(chǔ)[12]。然而近年來,研究發(fā)現(xiàn)Hp生物膜與抗生素耐藥性可能也存在相關(guān)性,相比于浮游態(tài)的細胞,生物膜細胞對抗生素的抵抗力可增加100~1000倍[13]。目前,已經(jīng)提出了多種生物膜增加抗生素耐藥性的可能機制:(1)由于細胞外基質(zhì)的物理屏障作用抗生素未能滲透生物膜;(2)由于生物膜內(nèi)營養(yǎng)限制而導致生物膜細胞生長緩慢;(3)生物膜內(nèi)細菌在多種壓力條件下增加了突變的頻率以及抗生素耐藥菌株的產(chǎn)生;(4)生物膜內(nèi)細菌通過基因水平轉(zhuǎn)移,整合接合元件和自然轉(zhuǎn)化增加了抗生素抗性的傳播[14]。盡管Hp生物膜形成對抗生素耐藥性的影響尚未得到充分證實,已有研究發(fā)現(xiàn)Hp生物膜的形成與克拉霉素耐藥存在相關(guān)性。Yonezawa H等[15]在研究中發(fā)現(xiàn),在CAM的最小抑菌濃度(MIC)水平上,Hp成熟(3d)生物膜相比于中間體(2d)生物膜明顯增加(由0.03增加至0.5μg/ml);在最小殺菌濃度水平上,生物膜細菌(1.0μg/ml)比浮游態(tài)細菌(0.25μg/ml)明顯增加。而且其發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過最低抑菌濃度的CAM處理后,Hp培養(yǎng)物生物膜的產(chǎn)量相比于非處理組增加了4倍(2d生物膜)和16倍(3d生物膜)。另一項研究發(fā)現(xiàn),Hp1174(葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運蛋白),這種主要促進子超家族(major facilitator superfamily,MFS)的外排泵在生物膜形成和多重耐藥Hp菌株中高度表達,提示外排泵在Hp生物膜抗生素耐藥性增加中起到一定的作用[16]。

        4 幽門螺桿菌生物膜與免疫逃逸的相關(guān)性

        Hp在感染時可引起宿主上皮細胞的促炎反應(yīng),導致免疫細胞的募集,表現(xiàn)為胃炎,盡管有強烈的免疫反應(yīng),但其仍可在體內(nèi)持續(xù)存在并最終導致慢性胃炎。然而目前關(guān)于Hp如何在免疫系統(tǒng)的攻擊下存活依然了解較少,生物膜的形成被認為可能是一種躲避宿主免疫攻擊的有效機制。生物膜保護細菌免受宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及吞噬細胞的吞噬。生物膜還可以為細菌的水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)提供一個理想的環(huán)境,這有助于產(chǎn)生一系列具有不同抗原與毒力特征的相關(guān)細菌,最終將為細菌提供混淆和壓倒宿主免疫系統(tǒng)的手段[17]。有研究發(fā)現(xiàn)感染者對Hp的記憶性CD4+T細胞應(yīng)答受損,這與Hp特異性調(diào)節(jié)T細胞并主動抑制其應(yīng)答相關(guān)[18],而這種抑制可能與Hp生物膜細胞外基質(zhì)中的蛋白多糖介導的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。另外,有研究表明應(yīng)用鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin,CP)處理Hp培養(yǎng)物可改變細菌外膜脂質(zhì)A結(jié)構(gòu),進而降低細菌表面的疏水性并增加生物膜的形成。CP是一種重要的抗菌因子,是營養(yǎng)免疫營養(yǎng)扣留過程的關(guān)鍵組分[19]。為了防止病原微生物感染,人類和其他哺乳動物通過營養(yǎng)免疫限制其獲取必需金屬[20]。很明顯,宿主的營養(yǎng)限制和細菌的營養(yǎng)獲取是傳染病發(fā)病機制中的關(guān)鍵過程。CP以高親和力結(jié)合Mn和Zn,限制這些必需金屬的傳遞,從而形成Mn和Zn限制的隔離環(huán)境。而Hp擁有通過改變外膜結(jié)構(gòu)促進生物膜形成來規(guī)避CP抗菌活性的能力[21]。

        5 總結(jié)

        綜上所述,Hp生物膜的形成在感染過程中具有不可忽視的作用。相比于浮游態(tài)的細菌,對Hp生物膜的研究似乎更貼近于其對人體致病過程的真實情況。在今后的研究中,應(yīng)鼓勵研究者創(chuàng)建接近體內(nèi)環(huán)境的生物膜體外模型。事實上,生物膜不僅可以存在于胃部,還可以存在于環(huán)境中,已有研究證實水源是Hp感染的一個重要來源,研究者通過多種分子學手段在河水中檢測到了Hp的DNA,盡管目前并無證據(jù)表明Hp可以在水源中形成生物膜,但其可能嵌入其他細菌形成的生物膜中,并在其中存活[22]。另有研究表明Hp可通過在蔬菜上形成生物膜來延長其存活期[23]。因此,生物膜的形成可能是Hp在胃外環(huán)境中重要的傳播方式。另一方面,隨著CAM耐藥率的提高,根除失敗率也日益增高,然而,目前,普遍依然使用浮游細胞評估Hp菌株對體外抗生素的敏感性,但體外MIC并非人胃中抗生素效應(yīng)的可靠預測因子,所以,作者認為對Hp生物膜形成能力的評估可以在預防和控制抗生素耐藥上發(fā)揮重要作用。此外,需要更多的研究進一步探索Hp生物膜的致病機制,針對其形成和在致病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)開發(fā)新的預防治療策略,為提高根除效率提供新的方案。

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