于巧玲，徐禮生，張興桃，李婷婷，葉 靜，孫，于 婷

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

哺乳動(dòng)物體內(nèi)不存在色氨酸合成途徑，人和動(dòng)物必須從外界獲取生長(zhǎng)所需要的色氨酸，而色氨酸合成酶能夠高效催化吲哚與L-絲氨酸反應(yīng)，合成L-色氨酸。因此，色氨酸合成酶發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，直接影響著色氨酸的產(chǎn)量。色氨酸作為第二必需氨基酸，參與調(diào)解人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，缺乏色氨酸將會(huì)降低人體消化功能和體液免疫功能。而對(duì)于結(jié)核桿菌，色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株很難在巨噬細(xì)胞中繁殖，甚至不能存活。因此，色氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料添加等領(lǐng)域，色氨酸的功效使得色氨酸合成酶成為研究結(jié)核藥物的核心目標(biāo)。20世紀(jì)50年代，固定化技術(shù)受到關(guān)注和研究，隨后高速發(fā)展，研究者把酶固定成球體，顯著改善了游離菌存在的不足。近年來(lái)，隨著對(duì)固定化技術(shù)更深層次的研究，酶的機(jī)械韌度和穩(wěn)定度得到了提高。從色氨酸合成酶的性質(zhì)、作用機(jī)理、酶固定化及應(yīng)用等4個(gè)方面進(jìn)行分析，以期為色氨酸合成酶工業(yè)化應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 色氨酸合成酶的性質(zhì)

色氨酸合成酶（TSase） 基因總長(zhǎng)807 bp，可編碼269個(gè)氨基酸[1]。色氨酸合成酶呈現(xiàn)出α2β2亞基結(jié)構(gòu)，其中α和β亞基能夠獨(dú)立編碼，單獨(dú)催化反應(yīng)，也可以相互激活調(diào)節(jié)催化反應(yīng)能力[2]。吲哚在α亞基活性部位產(chǎn)生，在β亞基活性中心發(fā)生反應(yīng)，兩亞基間的特殊通道作為“橋梁”協(xié)助反應(yīng)進(jìn)行[3]，因此色氨酸合成酶成為探索小分子的移動(dòng)運(yùn)送通道、分子運(yùn)送中的能量轉(zhuǎn)移路徑和活性部位間的相互作用、信號(hào)傳遞通道以亞基間互相影響的典范[4]。利用生物技術(shù)，克隆色氨酸合成酶基因trpBA，構(gòu)建表達(dá)載體pET-trpBA，色氨酸產(chǎn)量達(dá)9.8 mg/L，提高了4.9倍[5]。采用 PCR擴(kuò)增抗反饋抑制的serA和trpBA基因，將2個(gè)基因以多種方式串聯(lián)在pET22 b（+）上，在各自啟動(dòng)子作用下，2種蛋白酶共表達(dá)，檢測(cè)并篩選出TSase和PGDH酶活性較高的菌株ABA-I，搖床發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，該菌株色氨酸產(chǎn)量增加了20.2倍[6]。采用雙菌酶法，將來(lái)自不同菌的2種酶結(jié)合，利用酶的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，共同催化吲哚和DL-絲氨酸，提高底物轉(zhuǎn)化率。另外，利用色氨酸合成酶高產(chǎn)菌株，間歇式添加吲哚，同樣能夠達(dá)到高產(chǎn)色氨酸的目的?？寺　⒈磉_(dá)和純化色氨酸合成酶α，β亞基蛋白，研究重組蛋白的酶學(xué)特性，結(jié)果表明色氨酸合成酶β反應(yīng)最佳溫度為37℃，大于40℃時(shí)，酶活顯著降低，80℃的酶活只有10℃時(shí)的10%；最適pH值7.5，最佳Na+濃度為0.15 mol/L，最佳Mg2+濃度為0.18 mol/L；當(dāng)TRPSA/TRPSB的濃度比為1.411時(shí)，即摩爾比為2.2時(shí)，酶活最大[7]。

2 色氨酸合成酶的作用機(jī)理

研究顯示，吲哚在α活性部位產(chǎn)生后，經(jīng)過(guò)2個(gè)亞基間的特殊通道進(jìn)入β亞基活性中心與L-絲氨酸發(fā)生PLP依賴性反應(yīng)，在β亞基活性中心生成L-色氨酸[8]。晶體結(jié)構(gòu)顯示αββα亞基結(jié)構(gòu)中2個(gè)亞基活性中心相距25á，α，β反應(yīng)是相互促進(jìn)調(diào)節(jié)的。α亞基中，Glu-49和Asp-60是主要的活性位點(diǎn)殘基；Lys87和PLP結(jié)合構(gòu)成連體，在β亞基中催化反應(yīng)。吲哚是一種中等疏水性物質(zhì)，很容易從沒(méi)有引流通道的細(xì)胞中流失。在Salmonella typhimurium TSase中，2個(gè)亞基間形成顯著的疏水通道，β亞基反應(yīng)可抑制開(kāi)放相位和閉合相位的轉(zhuǎn)化[7]，有效防止吲哚損失，確保催化反應(yīng)的高效性。色氨酸合成酶催化indole-3-GP，形成靛藍(lán)的起始原料[9]，細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP） 催化吲哚生成吲哚酚[10]，吲哚酚在GL催化下生成靛藍(lán)的前體物質(zhì)[11]，并最終合成靛藍(lán)類色素物質(zhì)。

3 色氨酸合成酶固定化

固定化是一項(xiàng)重要的革新技術(shù)，酶的固定化是在蛋白質(zhì)固定化的發(fā)展下演變而來(lái)。可通過(guò)吸附、離子交換、交聯(lián)、包埋、共價(jià)連接物等方法將酶固定在特定載體或區(qū)域上[12]。相對(duì)于游離的單細(xì)胞而言，固定化酶在保持原有催化活力的同時(shí)，還具有產(chǎn)率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。將酶固定成球體，不僅增加了酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高細(xì)胞對(duì)底物和產(chǎn)物的耐受性，還有利于產(chǎn)物分離，有效控制生產(chǎn)過(guò)程。海藻酸鈉具備良好的穩(wěn)定性和較高的強(qiáng)度，是包埋游離菌的良好材料。然而，需要改進(jìn)由海藻酸鈉和戊二醛包埋制備的固定化細(xì)胞的吸附性和機(jī)械強(qiáng)度。因此，當(dāng)合成L-2-甲基色氨酸時(shí)，采用改性玉米秸稈纖維作為填料來(lái)制備固定化色氨酸合成酶基因工程菌[13]，有效改善了包埋法存在的不足。

4 色氨酸合成酶的應(yīng)用

克隆表達(dá)色氨酸合成酶α亞基基因，擴(kuò)增trpA基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大腸埃希菌DH5α作為宿主菌體，表達(dá)并純化色氨酸合成酶α亞基[4]，其功能研究為色氨酸合成酶的藥物挑選提供了參考依據(jù)。優(yōu)化密碼子，采用單因素和響應(yīng)面法研究最佳反應(yīng)條件，以甲硫醇和L-絲氨酸為反應(yīng)原料，制備S-甲基-L-半胱氨酸，從而為S-甲基-L-半胱氨酸的制備提供新方法[14]。構(gòu)建H37 vTRPSA和TRPSB氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)，分析色氨酸合成酶α，β亞基之間的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，TRPSA，TRPSB在分枝桿菌中是特異的、保守的。因此，H37 vTRPSA和TRPSB可以作為藥靶用于設(shè)計(jì)針對(duì)分枝桿菌的新型藥物[7]。針對(duì)增強(qiáng)色氨酸合成酶活性、提高底物的溶解度和反應(yīng)效率，以甲苯為有機(jī)相，在最佳反應(yīng)條件下催化合成2-甲基-L-色氨酸時(shí)，色氨酸合成酶具有最高的相對(duì)酶活性[15]。使用生物信息學(xué)方法分析和功能預(yù)測(cè)DMATS（二甲烯丙基色氨酸合成酶）蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)該基因家族的保守motif是設(shè)計(jì)編碼內(nèi)生真菌DMATS基因的RNA干擾引物的切入點(diǎn)，抑制該基因表達(dá)，影響合成堿的能力，從而使醉馬草“脫毒”成為“益草”[16]。目前，色氨酸合成酶反饋抑制位點(diǎn)的殘基尚無(wú)定論，將trpAB的活性位點(diǎn)與Thermus thermophiles TRPSB螯合PLP的模板進(jìn)行比較，找出PLP周圍適宜范圍內(nèi)的氨基酸殘基，利用定點(diǎn)突變，對(duì)具有最突出空間位置和作用力的位點(diǎn)進(jìn)行誘變，表達(dá)純化測(cè)定酶活，找到可能的活性中心位點(diǎn) Ser390，Ser99，Gln128，Ser249，Asn250，Glu364，Thr204，His100，發(fā)現(xiàn)突變后酶活下降明顯，因此鑒定這些位點(diǎn)對(duì)催化反應(yīng)有十分重要的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

酶的固定化和基因工程技術(shù)的應(yīng)用極大地推動(dòng)了生產(chǎn)色氨酸的工業(yè)化進(jìn)程，基因工程菌的構(gòu)建顯著提高了生產(chǎn)菌株的底物轉(zhuǎn)化能力。產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)使得基因工程菌的氨基酸生產(chǎn)水平逐漸滿足市場(chǎng)需求。同時(shí)，低污染、低成本的優(yōu)越生產(chǎn)方式深受研究者的青睞。作為基因工程菌，色氨酸合成酶高效的催化吲哚與絲氨酸反應(yīng)，合成L-色氨酸，使色氨酸在醫(yī)療保健、食品生產(chǎn)等方面發(fā)揮作用。通過(guò)吸附、離子交換、交聯(lián)、包埋、共價(jià)連接物等方法制備固定化酶，在保持酶活力的同時(shí)，有效控制生產(chǎn)過(guò)程，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。近年來(lái)，定向進(jìn)化技術(shù)飛速發(fā)展，未來(lái)色氨酸合成酶的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。