呂運(yùn)舟， 董筱昀， 楊小鑫， 孫海楠， 何開(kāi)躍， 黃利斌，①

(1. 江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院， 江蘇 南京 211153； 2. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 江蘇 南京 210037)

隨著人們對(duì)居住環(huán)境要求的不斷提高，彩葉觀賞植物逐漸成為現(xiàn)代園林配置的重要組成部分[1-2]。葉色變異植株為植物彩葉新品種選育提供了理想材料[3]，并在光合作用機(jī)制[4]、激素調(diào)控[5]和功能基因組學(xué)[6]等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。葉片色素是葉色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)和關(guān)鍵因子，多數(shù)植物葉片黃化主要是因?yàn)檫z傳和環(huán)境因子共同作用，影響葉綠素的合成和穩(wěn)定性，從而影響不同色素間的比例[7-8]。

黃山欒樹(shù)(KoelreuteriabipinnataFranch.)隸屬于無(wú)患子科(Sapindaceae)欒樹(shù)屬(KoelreuteriaLaxm.)，為高大喬木，是中國(guó)優(yōu)良的鄉(xiāng)土樹(shù)種之一。該種具有多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和園林觀賞價(jià)值，是園林綠化、庭院配植的理想樹(shù)種[9]。‘金焰彩欒’(‘Jinyan’)為黃山欒樹(shù)的一個(gè)新品種，來(lái)源于黃山欒樹(shù)的天然黃化突變體，枝干呈橙黃色，秋季全株金黃，觀賞價(jià)值極高[9]。迄今為止，研究者已經(jīng)初步鑒定出‘金焰彩欒’體內(nèi)部分表達(dá)模式與黃山欒樹(shù)存在差異的色素合成基因[10-11]，并對(duì)其呈色期葉片色素含量進(jìn)行了初步測(cè)定和分析[12]，但關(guān)于‘金焰彩欒’葉片呈色的具體生理生化機(jī)制仍不清楚，有待深入研究。

鑒于此，以黃山欒樹(shù)實(shí)生苗為對(duì)照，對(duì)‘金焰彩欒’葉片發(fā)育過(guò)程中葉色參數(shù)以及葉片的色素含量和比值、含水量、細(xì)胞液pH值及可溶性糖含量的變化進(jìn)行了研究，并對(duì)葉色參數(shù)與色素含量進(jìn)行了多元逐步線性回歸分析，以期明確影響‘金焰彩欒’葉片呈色的主要因子，為探討其葉片呈色的生理機(jī)制及選育欒樹(shù)屬植物彩葉新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 研究地概況和研究方法

1.1 研究地概況

實(shí)驗(yàn)地設(shè)在江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃地內(nèi)，該苗圃地位于南京市江寧區(qū)南部，具體地理坐標(biāo)為東經(jīng)118°46′、北緯31°51′。該區(qū)域?qū)俦眮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，年均溫15.4 ℃，年降水量1 031 mm，無(wú)霜期227 d。土壤為黃棕壤，呈酸性(pH 5至pH 6)，肥力中等。

1.2 材料

在苗圃地內(nèi)分別選取3株樹(shù)齡4 a、長(zhǎng)勢(shì)一致的‘金焰彩欒’嫁接苗和黃山欒樹(shù)實(shí)生苗作為樣株。根據(jù)‘金焰彩欒’葉片呈色的變化特征[9]，分別于2015年的4月14日、4月27日、5月19日、6月16日、7月15日、8月26日、9月17日、10月28日和11月27日觀察樣株的葉色并拍照，同時(shí)，采集樣株樹(shù)梢中上部枝條上的成熟功能葉(即側(cè)枝上第3對(duì)復(fù)葉的第3至第5枚完全展開(kāi)的小葉)，每株采集3枚小葉。將采集的小葉置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，待測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 葉色參數(shù)及色素含量測(cè)定 參照楊淑紅等[13]的方法，采用CR-410色彩色差儀(日本Konica Minolta公司)測(cè)定葉片中部(避開(kāi)葉脈)的葉色參數(shù)(包括L*、a*和b*值)。參照Lichtenthaler等[14]的方法測(cè)定葉片中葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的含量，參照Pirie等[15]的方法測(cè)定葉片中花色素苷(Acy)含量，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算總?cè)~綠素(Chl)含量(即Chla和Chlb含量之和)以及Chla/Chlb、Car/Chl和Acy/Chl值。各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 含水量、細(xì)胞液pH值及可溶性糖含量測(cè)定

取新鮮葉片，先使用梅特勒-托利多AL204電子天平(精度0.1 g)稱量鮮質(zhì)量(FW)，再置于105 ℃條件下殺青15 min，然后在75 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量(DW)，根據(jù)稱量結(jié)果計(jì)算葉片含水量(WC)，計(jì)算公式為WC=〔(FW-DW)/FW〕×100%。參照馬樹(shù)華等[16]的方法測(cè)定葉片的細(xì)胞液pH值。參照鄭恬靜等[17]的方法測(cè)定葉片的可溶性糖含量。各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用EXCEL 2003和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用one-way ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉色變化

觀察(圖1)發(fā)現(xiàn)，‘金焰彩欒’的新葉在3月下旬至4月下旬呈橙紅色，成熟葉在5月上旬至9月下旬一直呈黃綠色，在10月上旬至11月下旬呈金黃色；而實(shí)生苗葉片在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中基本呈綠色，僅在11月中旬開(kāi)始變?yōu)辄S色。

2.2 葉色相關(guān)指標(biāo)變化

2.2.1 葉色參數(shù)變化 葉色參數(shù)變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)表明：‘金焰彩欒’葉片的L*值在4月14日至6月16日相對(duì)穩(wěn)定，自7月15日開(kāi)始持續(xù)顯著(P<0.05)升高，于10月28日達(dá)到最高值(82.94)，隨后顯著降低；a*值在4月14日達(dá)到最高值(56.93)，隨后持續(xù)降低，在8月26日降到最低值(-21.54)，隨后持續(xù)回升，至11月27日達(dá)到7.81；b*值在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在5月19日降到最低值(19.69)，并在11月27日達(dá)到最高值(46.35)。

A，B，C： 分別示‘金焰彩欒’在春季、夏季和秋季的葉片顏色Showing leaf color of ‘Jinyan’ in spring， summer， and autumn， respectively； D，E，F(xiàn)： 分別示實(shí)生苗在春季、夏季和秋季的葉片顏色Showing leaf color of seedling in spring， summer， and autumn， respectively.

表1 黃山欒樹(shù)的新品種‘金焰彩欒’及實(shí)生苗葉色參數(shù)的變化

整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’的L*和b*值均為正值，并且，除4月27日外，‘金焰彩欒’的L*和b*值在其余日期均極顯著(P<0.01)高于實(shí)生苗?！鹧娌蕶琛腶*值在4月14日、4月27日、10月28日和11月27日為正值，在其余日期為負(fù)值，而實(shí)生苗的a*值始終為負(fù)值；且‘金焰彩欒’的a*值在6月16日至9月17日低于或極顯著低于實(shí)生苗，在其余日期極顯著高于實(shí)生苗。

2.2.2 色素組成及比值變化 葉片色素組成及比值變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)表明：整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’葉片葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和總?cè)~綠素(Chl)含量大體呈先升高后降低的趨勢(shì)，且一直維持在較低水平?！鹧娌蕶琛~片Chla、Chlb和Chl含量均在4月14日降到最低值(分別為0.05、0.01和0.06 mg·g-1)，并隨著時(shí)間推移而升高，在9月17日達(dá)到最高值(分別為1.95、0.28和2.23 mg·g-1)，隨后降低。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’葉片Chla、Chlb和Chl含量基本上極顯著低于實(shí)生苗。此外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’葉片Chla/Chlb值始終高于實(shí)生苗，且除11月27日外，其余日期‘金焰彩欒’和實(shí)生苗間的Chla/Chlb值均差異顯著或極顯著。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’葉片類胡蘿卜素(Car)和花色素苷(Acy)含量均呈明顯的波動(dòng)變化，分別在4月27日和10月28日達(dá)到最高值，在11月27日分別為4月14日的3.4和1.3倍；而‘金焰彩欒’葉片Car/Chl和Acy/Chl值則大體呈“迅速降低—保持穩(wěn)定—逐漸升高”的趨勢(shì)。另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’葉片Car和Acy含量極顯著低于實(shí)生苗，而葉片Car/Chl和Acy/Chl值卻顯著或極顯著高于實(shí)生苗(6月16日除外)。

表2 黃山欒樹(shù)的新品種‘金焰彩欒’及實(shí)生苗葉片色素含量及比值的變化

2.2.3 含水量、細(xì)胞液pH值和可溶性糖含量變化

統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3)表明：整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，‘金焰彩欒’葉片含水量大體呈逐漸降低的趨勢(shì)；細(xì)胞液pH值大體呈先降低后升高的趨勢(shì)；可溶性糖含量大體呈“降低—升高—降低—升高”的趨勢(shì)，在4月27日降到最低值(10.63 mg·g-1)，在7月15日達(dá)到最高值(24.89 mg·g-1)。

除11月27日外，其余日期‘金焰彩欒’和實(shí)生苗間的葉片含水量均差異顯著或極顯著，且除8月26日外，‘金焰彩欒’葉片含水量均高于實(shí)生苗?！鹧娌蕶琛~片細(xì)胞液pH值在4月27日極顯著高于實(shí)生苗，在5月19日和7月15日極顯著低于實(shí)生苗，在9月17日和10月28日顯著低于實(shí)生苗?！鹧娌蕶琛~片可溶性糖含量在4月14日和11月27日均極顯著高于實(shí)生苗，在8月26日極顯著低于實(shí)生苗，在6月16日和9月17日顯著低于實(shí)生苗。

表3 黃山欒樹(shù)的新品種‘金焰彩欒’及實(shí)生苗葉片含水量、細(xì)胞液pH值和可溶性糖含量的變化

2.3 多元逐步線性回歸分析

分別以L*、a*和b*值為因變量，‘金焰彩欒’葉片總?cè)~綠素(Chl)、類胡蘿卜素(Car)和花色素苷(Acy)含量為自變量，進(jìn)行多元逐步線性回歸分析，獲得的回歸方程分別為L(zhǎng)*=32.776+100.583Car(R=0.619，P<0.05)、a*=38.829-30.399Chl(R=0.724，P<0.05)和b*=9.414+78.124Car(R=0.533，P<0.05)，說(shuō)明‘金焰彩欒’葉片的葉色參數(shù)與Chl和Car含量密切相關(guān)。其中，a*值與Chl含量顯著負(fù)相關(guān)，即隨著Chl含量增加，葉片綠色調(diào)增強(qiáng)；L*和b*值與Car含量顯著正相關(guān)，即隨著Car含量增加，葉片黃色調(diào)和整體明度增強(qiáng)。

3 討論和結(jié)論

研究表明：色素類型和含量是影響植物葉色的最主要和最直接的因子[18-20]，多數(shù)植物葉色突變體表型由葉綠素含量下降引起[21-23]。本研究結(jié)果也表明：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，黃山欒樹(shù)新品種‘金焰彩欒’葉片的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和總?cè)~綠素(Chl)含量基本上極顯著低于實(shí)生苗，而‘金焰彩欒’葉片的Chla/Chlb值卻基本上顯著或極顯著高于實(shí)生苗，說(shuō)明‘金焰彩欒’葉片的葉綠素合成通路可能受阻，且Chlb含量的降幅更大。然而，關(guān)于‘金焰彩欒’葉片葉綠素合成受阻及調(diào)控通路的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。葉綠素a酸酯氧化酶(chlorophyllideaoxygenase，CAO)是催化Chla轉(zhuǎn)化成Chlb的關(guān)鍵酶[24]，‘金焰彩欒’葉片CAO基因的表達(dá)水平顯著低于實(shí)生苗[10]，說(shuō)明‘金焰彩欒’可通過(guò)調(diào)控CAO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平調(diào)控Chlb的合成，從而提高Chla/Chlb值，使葉片呈現(xiàn)黃色。另外，多元逐步線性回歸分析結(jié)果表明：‘金焰彩欒’葉片a*值與Chl含量顯著負(fù)相關(guān)，L*和b*值與Car含量顯著正相關(guān)，說(shuō)明‘金焰彩欒’葉片呈色與Chl和Car含量密切相關(guān)。

郁萬(wàn)文等[25]的研究結(jié)果表明：Car/Chl值升高是銀杏(GinkgobilobaLinn.)金葉品種‘萬(wàn)年金’(‘Wannianjin’)半同胞子代無(wú)性系葉片呈黃色的主要原因。本研究中，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(即4月14日)，‘金焰彩欒’葉片的Chl含量極低(0.06 mg·g-1)，但Car/Chl和Acy/Chl值卻最大，葉片呈橙紅色；隨后，Car/Chl值持續(xù)下降，當(dāng)Car/Chl值低于0.28時(shí)，葉片呈黃綠色或綠色；入秋后，Chl含量下降，但Car/Chl值升高，葉片呈金黃色。說(shuō)明‘金焰彩欒’葉片呈色與Car/Chl值有關(guān)。

綜上所述，‘金焰彩欒’葉色的適宜觀賞期為春季和秋季，夏季葉片出現(xiàn)復(fù)綠現(xiàn)象，觀賞價(jià)值降低?！鹧娌蕶琛~色變化是多種因子綜合作用的結(jié)果，Chl和Car含量及Car/Chl值為主要影響因子。