徐 曙， 趙興增， 周 倩， 陳虞超， 李林蔚，①， 郭生虎，①

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心， 寧夏 銀川 750002〕

植物病害是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因子，每年植物病害的發(fā)生都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；瘜W(xué)防治是控制植物病害的重要手段，然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題和病原菌抗藥性問(wèn)題[1]。開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥是緩解上述問(wèn)題的有效途徑之一。植物源活性成分具有來(lái)源豐富、作用方式特異、不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)環(huán)境友好及對(duì)非靶標(biāo)生物相對(duì)安全等特點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的理想對(duì)象[2]。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根和根莖為常用中藥材，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳以及調(diào)和諸藥等功效；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：甘草還具有抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和保肝等作用[3]。此外，甘草根部及莖葉提取物對(duì)多種植物病原真菌和卵菌的菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用[4-6]，而甘草黃酮類化合物可能是其主要抑菌活性成分之一[6]。

甘草黃酮類化合物是甘草中一類重要的化學(xué)成分，具有豐富的生物活性[7]，其中部分黃酮類化合物對(duì)包括植物病原菌在內(nèi)的多種微生物的抑菌活性較強(qiáng)，可作為生物農(nóng)藥先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)利用[8-12]。例如：甘草素、異甘草素、半甘草異黃酮B和光甘草定等化合物對(duì)多種植物病原真菌、卵菌和細(xì)菌具有顯著的抑菌作用[8，13-15]。然而，目前甘草黃酮類化合物對(duì)植物病原菌抑菌活性的研究仍不全面，影響其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。

為進(jìn)一步探明甘草黃酮類化合物對(duì)植物病原菌的抑菌活性，作者采用硅膠柱層析和重結(jié)晶方法從甘草根中分離和提取了6個(gè)黃酮類化合物單體，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后獲得了3個(gè)乙酰化衍生物，并使用核磁共振和旋光技術(shù)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定；采用菌絲生長(zhǎng)速率法和比濁法測(cè)定這9個(gè)化合物在10 μg·mL-1時(shí)對(duì)植物病原真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制率，并進(jìn)一步測(cè)定了具有抑菌活性的黃酮類化合物對(duì)植物病原菌的EC50(有效中濃度)和EC90(抑制率90%時(shí)的化合物濃度)值，以期探明這9個(gè)化合物對(duì)植物病原菌的抑菌活性，并為甘草的資源化利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試人工栽培甘草根于2018年10月采自寧夏回族自治區(qū)吳忠市鹽池縣高沙窩鎮(zhèn)，經(jīng)寧夏農(nóng)林科學(xué)院郭生虎研究員鑒定。供試菌種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周明國(guó)教授提供，包括水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、枸杞炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)和稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)7種真菌以及水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)1種細(xì)菌。培養(yǎng)真菌所用的PSA培養(yǎng)基含200 g·L-1去皮土豆的浸出液、20 g·L-1蔗糖和16 g·L-1瓊脂粉[16]；培養(yǎng)細(xì)菌所用的NB培養(yǎng)液含3 g·L-1牛肉浸膏、5 g·L-1多聚蛋白胨、1 g·L-1酵母浸膏和10 g·L-1蔗糖，pH 7.0[17]。所有培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min后待用。

儀器和試劑：Jasco P-1020全自動(dòng)數(shù)字旋光儀(日本Jasco公司)；Bruker AV-500 MHz型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；柱層析色譜硅膠(200～300目)(青島海洋化工廠)；薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠)；EYELA N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本東京理化器械株式會(huì)社)；DF-110集熱式磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；721G可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；SPX-250BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。乙酸乙酯(分析純)、石油醚(分析純)、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(分析純)、甲醇(分析純)、三氯甲烷(化學(xué)純)、三乙胺(化學(xué)純)、乙酸酐(化學(xué)純)、吡啶(化學(xué)純)、4-二甲氨基吡啶(化學(xué)純)和無(wú)水硫酸鈉(分析純)購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲基硫菌靈(純度99%)和噻枯唑(純度95%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；配制培養(yǎng)基所用試劑及耗材購(gòu)自南京壽德試驗(yàn)器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取和分離 將5 kg干燥的甘草根粉碎，然后用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇加熱回流提取3次，提取液合并后，減壓濃縮至無(wú)醇味，所得浸膏加5 L蒸餾水溶解，然后用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，得乙酸乙酯部分浸膏200 g。浸膏經(jīng)硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比100∶0至0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.1至Fr.10共10個(gè)組分。其中Fr.2(11.55 g)經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、純化和甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅰ(21 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比20∶1)〕、化合物Ⅱ(16 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)〕和化合物Ⅲ(19 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)和三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)〕；Fr.5(9.43 g)經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、純化和甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅳ(28 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比5∶1至1∶1)〕和化合物Ⅴ(23 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比5∶1至1∶1)〕；Fr.7(7.86 g)經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、純化和甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅵ(116 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)和三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(體積比50∶1至10∶1)〕。

1.2.2 衍生物合成

1.2.2.1 4，4′-O-二乙?；惛什菟?化合物Ⅶ)的合成 將異甘草素(500.00 mg，1.95 mmol)和吡啶(4.00 mL)混合均勻，升溫至80 ℃，加入乙酸酐(0.40 mL，4.25 mmol)和4-二甲氨基吡啶(4.00 mg，0.12 mmol)，反應(yīng)6 h后，待反應(yīng)液稍冷，倒入15 mL蒸餾水中，并在冰浴下持續(xù)攪拌30 min。待沉淀完全后抽濾，濾餅用少量蒸餾水淋洗，自然干燥，得黃色固體501.72 mg，收率75.6%。

1.2.2.2 4-O-乙?；惛什菟?化合物Ⅷ)的合成

將異甘草素(500.00 mg，1.95 mmol)和吡啶(2.00 mL)混合均勻，升溫至80 ℃，加入乙酸酐(0.20 mL，2.12 mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.00 mg，0.06 mmol)，反應(yīng)4 h后，待反應(yīng)液稍冷，倒入10 mL蒸餾水中，并在冰浴下持續(xù)攪拌30 min。待沉淀完全后抽濾，濾餅用少量蒸餾水淋洗，自然干燥，得黃色固體472.34 mg，收率81.2%。

1.2.2.3 4′-O-乙?；什菟?化合物Ⅸ)的合成

將甘草素(500.00 mg，1.95 mmol)和吡啶(2.00 mL)混合均勻，升溫至80 ℃，加入乙酸酐(0.20 mL，2.12 mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.00 mg，0.06 mmol)，反應(yīng)4 h后，待反應(yīng)液稍冷，倒入10 mL蒸餾水中，并在冰浴下持續(xù)攪拌30 min。待沉淀完全后抽濾，濾餅用少量蒸餾水淋洗，自然干燥，得白色固體428.93 mg，收率73.7%。

上述3個(gè)乙?；苌锏暮铣陕肪€見(jiàn)圖1。

1.2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 使用核磁共振儀和旋光儀對(duì)上述9個(gè)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定

1.2.4.1 對(duì)植物病原真菌抑菌活性的測(cè)定 將各化合物單體溶于二甲基亞砜(DMSO)，配制成10 000 μg·mL-1母液。將PSA培養(yǎng)基加熱融化后室溫放置，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右時(shí)，加入母液使其終濃度為10 μg·mL-1，倒入直徑6 cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板，以含等體積DMSO的PSA平板作為溶劑對(duì)照，以等濃度甲基硫菌靈為對(duì)照藥劑，另設(shè)PSA空白平板(不加溶劑或者藥液)作為空白對(duì)照。將7種真菌分別接種于PSA平板上，并在25 ℃生化培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。用打孔器在預(yù)培養(yǎng)的生長(zhǎng)旺盛的菌落邊緣取直徑5 mm的菌碟，并接種于空白對(duì)照、溶劑對(duì)照和含藥PSA平板上，然后在25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至空白對(duì)照接近長(zhǎng)滿平板。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(扣除菌碟直徑5 mm)。抑制率計(jì)算公式為抑制率=〔(溶劑對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/溶劑對(duì)照菌落直徑〕×100%。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 對(duì)植物病原細(xì)菌抑菌活性的測(cè)定 在NB培養(yǎng)液中接種細(xì)菌并在28 ℃、175 r·min-1條件下預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用可見(jiàn)分光光度計(jì)調(diào)節(jié)濁度(OD600)至0.02，待用。將各化合物溶于DMSO，配制成10 000 μg·mL-1母液。向NB培養(yǎng)液中加入母液使其終濃度為10 μg·mL-1，以含等體積DMSO的NB培養(yǎng)液作為溶劑對(duì)照，以等濃度噻枯唑?yàn)閷?duì)照藥劑，另設(shè)NB空白培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。向每25 mL的NB含藥培養(yǎng)液中加入100 μL濁度0.02的細(xì)菌懸浮液，在28 ℃、175 r·min-1條件下培養(yǎng)至空白對(duì)照對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定菌液濁度。抑制率計(jì)算公式為抑制率=〔(溶劑對(duì)照菌液濁度-藥劑處理菌液濁度)/溶劑對(duì)照菌液濁度〕×100%。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 室內(nèi)毒力回歸方程計(jì)算 將各化合物溶于DMSO，配制成10 000 μg·mL-1母液，根據(jù)10 μg·mL-1各化合物對(duì)不同病原菌的抑制率設(shè)計(jì)濃度梯度，并使用DMSO對(duì)母液進(jìn)行稀釋，得到6個(gè)不同濃度的化合物溶液。按照上述方法制備含藥PSA平板或含藥NB培養(yǎng)液，并設(shè)置溶劑對(duì)照，然后接種、培養(yǎng)病原菌，測(cè)定結(jié)果后計(jì)算抑制率，并計(jì)算毒力回歸方程、EC50值和EC90值[18]。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用EXCEL 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 甘草根中黃酮類化合物鑒定

甘草根中6個(gè)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

化合物Ⅰ：白色粉末。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.06(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.92(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，6.71(1H，d，J=9.9 Hz，H-1″)，6.53(1H，dd，J=8.5，2.3 Hz，H-5′)，6.49(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.40(1H，d，J=2.2 Hz，H-3′)，5.61(1H，d，J=9.9 Hz，H-2″)，5.14(1H，s，OH-2′)，4.43(1H，dd，J=10.4，2.6 Hz，H-2-cis)，4.09(1H，t，J=10.2 Hz，H-2-trans)，3.81(3H，s，OCH3-4″)，3.58-3.56(1H，m，H-3)，3.04(1H，dd，J=15.9，10.9 Hz，H-4-trans)，2.92(1H，dd，J=15.6，3.7 Hz，H-4-cis)，1.48(3H，s，CH3-4″)，1.44(3H，s，CH3-5″)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：159.4(C-4′)，154.3(C-7)，151.9(C-8a)，149.8(C-2′)，129.2(C-6′)，128.9(C-2″)，128.2(C-5)，120.0(C-1′)，117.0(C-1″)，114.4(C-4a)，110.0(C-8)，108.7(C-6)，106.1(C-5′)，102.2(C-3′)，75.7(C-3″)，70.0(C-2)，55.3(OCH3-4′)，31.8(C-3)，30.6(C-4)，27.8(C-4″)，27.6(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為4′-O-甲基光甘草定(4′-O-methylglabridin)。

化合物Ⅲ：白色粉末。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.36(1H，s，OH-2′)，9.09(1H，s，OH-4′)，6.88(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.85(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，6.57(1H，d，J=9.9 Hz，H-1″)，6.36(1H，d，J=2.0 Hz，H-3′)，6.31(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.22(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-5′)，5.67(1H，d，J=9.9 Hz，H-2″)，4.27(1H，dd，J=10.0，2.1 Hz，H-2-cis)，3.97(1H，t，J=10.0 Hz，H-2-trans)，3.35-3.31(1H，m，H-3)，2.73(1H，dd，J=15.0，12.5 Hz，H-4-trans)，2.53(1H，dd，J=15.0，2.0 Hz，H-4-cis)，1.37(3H，s，CH3-4″)，1.36(3H，s，CH3-5″)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：156.7(C-7)，154.5(C-4′)，152.1(C-8a)，150.4(C-2′)，130.1(C-2′)，128.4(C-5)，126.9(C-6′)，118.8(C-1′)，117.2(C-1″)，112.7(C-4a)，108.8(C-6)，108.0(C-5′)，107.4(C-8)，102.6(C-3′)，75.3(C-3″)，69.5(C-2)，31.0(C-4)，30.1(C-3)，27.4(C-4″)，27.3(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為光甘草定(glabridin)。

化合物Ⅳ：白色粉末，體積分?jǐn)?shù)10%H2SO4顯黃色。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.77(1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，7.36(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.86(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.53(1H，dd，J=8.6，2.4 Hz，H-6)，6.40(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，5.41(1H，dd，J=13.0，3.0 Hz，H-2)，3.07(1H，dd，J=17.0，13.0 Hz，H-3-trans)，2.72(1H，dd，J=17.0，3.0 Hz，H-3-cis)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：191.4(C-4)，165.7(C-7)，164.2(C-8a)，158.7(C-4′)，131.5(C-1′)，129.3(C-5)，129.0(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，115.3(C-4a)，111.6(C-6)，103.2(C-8)，80.6(C-2)，44.9(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為甘草素(liquiritigenin)。

化合物Ⅴ：黃色粉末，體積分?jǐn)?shù)10%H2SO4顯橙黃色。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.16(1H，d，J=9.2 Hz，H-6′)，7.76(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)，7.75(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，7.72(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，6.84(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.40(1H，dd，J=9.2，2.4 Hz，H-5′)，6.28(1H，d，J=2.4 Hz，H-3′)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：192.3(C=O)，166.9(C-4′)，165.2(C-2′)，160.1(C-4)，144.6(C-β)，133.3(C-6′)，131.7(C-2，6)，128.2(C-1)，117.9(C-α)，116.6(C-3，5)，113.9(C-1′)，109.2(C-5′)，103.7(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為異甘草素(isoliquiritigenin)。

Ⅰ： 4′-O-甲基光甘草定4′-O-methylglabridin； Ⅱ： Hispaglabridin B； Ⅲ： 光甘草定Glabridin； Ⅳ： 甘草素Liquiritigenin； Ⅴ： 異甘草素Isoliquiritigenin； Ⅵ： 甘草苷Liquiritin.

2.2 甘草根中黃酮類化合物的乙酰化衍生物鑒定

甘草根中黃酮類化合物的3個(gè)乙?；苌锏慕Y(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

化合物Ⅶ：1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.02(1H，s，OH-2′)，7.96(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，7.94(1H，d，J=15.4 Hz，H-β)，7.72(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，7.58(1H，d，J=15.4 Hz，H-α)，7.23(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.84(1H，d，J=2.2 Hz，H-3′)，6.77(1H，dd，J=8.8，2.2 Hz，H-5′)，2.37(3H，s，CH3-2″)，2.36(3H，s，CH3-2?)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：192.6(C=O)，169.0(C-1″)，168.4(C-1?)，165.2(C-2′)，156.7(C-4′)，152.7(C-4)，144.5(C-β)，132.2(C-1)，130.8(C-2，6)，129.8(C-6′)，122.3(C-3，5)，120.2(C-α)，117.9(C-1′)，112.8(C-5′)，111.3(C-3′)，21.2(C-2″)，21.1(C-2?)。故鑒定該化合物為4，4′-O-二乙?；惛什菟?4，4′-O-diacetylisoliquiritigenin)。

化合物Ⅷ：1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.29(1H，s，OH-2′)，7.83(1H，d，J=15.4 Hz，H-β)，7.78(1H，d，J=8.8 Hz，H-6′)，7.63(2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6)，7.46(1H，d，J=15.5 Hz，H-α)，7.16(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.40(1H，dd，J=8.8，1.9 Hz，H-5′)，6.35(1H，d，J=1.9 Hz，H-3′)，5.85(1H，s，OH-4′)，2.33(3H，s，CH3-2″)。故鑒定該化合物為4-O-乙?；惛什菟?4-O-acetylisoliquiritigenin)。

Ⅶ： 4，4′-O-二乙?；惛什菟?，4′-O-diacetylisoliquiritigenin； Ⅷ： 4-O-乙?；惛什菟?-O-acetylisoliquiritigenin； Ⅸ： 4′-O-乙?；什菟?′-O-acetylliquiritigenin.

化合物Ⅸ：1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.62(1H，s，OH-7)，7.70(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，7.60(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.21(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.57(1H，dd，J=8.7，2.1 Hz，H-6)，6.42(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.63(1H，dd，J=12.8，2.7 Hz，H-2)，3.15(1H，dd，J=16.7，12.8 Hz，H-3-trans)，2.78(1H，dd，J=16.7，2.9 Hz，H-3-cis)，2.31(3H，s，CH3-2″)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：190.07(C-4)，169.62(C-1″)，165.16(C-7)，163.41(C-8a)，150.92(C-4′)，137.06(C-1′)，128.91(C-5)，128.30(C-2′，6′)，122.38(C-3′，5′)，114.04(C-4a)，111.16(C-6)，103.08(C-8)，78.94(C-2)，43.66(C-3)，21.27(C-2″)。故鑒定該化合物為4′-O-乙?；什菟?4′-O-acetylliquiritigenin)。

2.3 甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌锏囊志钚?/h3>

2.3.1 對(duì)植物病原菌的抑制率 10 μg·mL-1甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌飳?duì)植物病原菌的抑制率見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：在10 μg·mL-1時(shí)，4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定對(duì)大部分供試病原菌的抑制率較高。其中，4′-O-甲基光甘草定對(duì)水稻紋枯病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率顯著高于對(duì)照藥劑甲基硫菌靈，對(duì)小麥赤霉病菌和香蕉枯萎病菌的抑制率與甲基硫菌靈無(wú)顯著差異；hispaglabridin B對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制率顯著高于甲基硫菌靈，對(duì)小麥赤霉病菌的抑制率與甲基硫菌靈無(wú)顯著差異；光甘草定對(duì)水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率顯著高于甲基硫菌靈，對(duì)油菜菌核病菌的抑制率與甲基硫菌靈無(wú)顯著差異。

表1 10 μg·mL-1甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌飳?duì)植物病原菌的抑制率

異甘草素對(duì)水稻白葉枯病菌的抑制率達(dá)76.25%，與對(duì)照藥劑噻枯唑無(wú)顯著差異，但對(duì)供試真菌的抑制率均未超過(guò)20.00%；4，4′-O-二乙?；惛什菟貙?duì)水稻白葉枯病菌的抑制率高于30.00%，但顯著低于噻枯唑，對(duì)供試真菌(小麥赤霉病菌除外)的抑制率低于20.00%；4-O-乙?；惛什菟貙?duì)水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和水稻白葉枯病菌的抑制率高于30.00%，其中，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率與甲基硫菌靈無(wú)顯著差異，但對(duì)其他植物病原菌的抑制率均低于20.00%。

此外，甘草素、甘草苷和4′-O-乙酰基甘草素對(duì)所有供試病原菌的抑制率均未超過(guò)20.00%，抑菌活性較低。

2.3.2 對(duì)植物病原菌的EC50和EC90值 鑒于10 μg·mL-14′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B、光甘草定和4-O-乙?；惛什菟貙?duì)供試植物病原真菌和細(xì)菌具有較好的抑菌活性，因此，進(jìn)一步測(cè)定了這4個(gè)化合物對(duì)所有供試病原菌的室內(nèi)毒力；此外，10 μg·mL-1異甘草素和4，4′-O-二乙?；惛什菟貙?duì)供試細(xì)菌具有較好的抑菌活性，因此，測(cè)定了這2個(gè)化合物對(duì)供試細(xì)菌的室內(nèi)毒力。結(jié)果(表2)顯示：總體上看，在10 μg·mL-1時(shí)，上述6個(gè)化合物對(duì)供試植物病原菌的抑制率越高，其對(duì)供試植物病原菌的EC50和EC90值越低。

4′-O-甲基光甘草定具有廣譜抑菌活性，對(duì)油菜菌核病菌、黃瓜灰霉病菌和稻瘟病菌的EC50值分別為5.75、5.30和9.61 μg·mL-1，EC90值分別為33.29、26.82和56.60 μg·mL-1，抑菌效果較好，其中，對(duì)黃瓜灰霉病菌的EC50和EC90值顯著低于甲基硫菌靈。此外，4′-O-甲基光甘草定對(duì)水稻紋枯病菌的EC50和EC90值與甲基硫菌靈總體上無(wú)顯著差異；對(duì)小麥赤霉病菌的EC50值與甲基硫菌靈無(wú)顯著差異，但EC90值顯著高于甲基硫菌靈；對(duì)香蕉枯萎病菌、枸杞炭疽病菌和水稻白葉枯病菌也具有一定的抑菌活性，但其EC50和EC90值顯著高于對(duì)照藥劑。

Hispaglabridin B也具有廣譜抑菌活性，但其抑菌活性總體上弱于4′-O-甲基光甘草定，其中，對(duì)黃瓜灰霉病菌的EC50和EC90值顯著低于甲基硫菌靈；對(duì)稻瘟病菌的EC50值僅4.11 μg·mL-1，與甲基硫菌靈無(wú)顯著差異，但EC90值顯著高于甲基硫菌靈；對(duì)其他供試病原菌的EC50和EC90值均顯著高于對(duì)照藥劑。

表2 甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌飳?duì)植物病原菌的EC50和EC90值

光甘草定具有廣譜抑菌活性，且其抑菌活性總體上強(qiáng)于4′-O-甲基光甘草定。除了對(duì)枸杞炭疽病菌的EC50值為48.90 μg·mL-1外，光甘草定對(duì)其他供試病原菌的EC50值均低于10.00 μg·mL-1，其中，對(duì)水稻紋枯病菌、香蕉枯萎病菌和黃瓜灰霉病菌的EC50和EC90值均顯著低于甲基硫菌靈；對(duì)小麥赤霉病菌的EC50值顯著低于甲基硫菌靈，但EC90值無(wú)顯著差異；對(duì)油菜菌核病菌和稻瘟病菌具有較為強(qiáng)烈的抑菌活性，但EC50和EC90值均顯著高于甲基硫菌靈；對(duì)枸杞炭疽病菌和水稻白葉枯病菌具有一定的抑菌活性，但EC50和EC90值均顯著高于對(duì)照藥劑。

異甘草素對(duì)水稻白葉枯病菌的EC50和EC90值分別為2.98和24.79 μg·mL-1，與噻枯唑無(wú)顯著差異，并明顯低于其他5個(gè)化合物。4，4′-O-二乙?；惛什菟貙?duì)水稻白葉枯病菌具有一定的抑菌活性，但EC50和EC90值顯著高于噻枯唑。4-O-乙?；惛什菟貙?duì)水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和水稻白葉枯病菌具有一定的抑菌活性，但EC50和EC90值顯著高于對(duì)照藥劑，對(duì)其他供試病原菌無(wú)抑菌活性或抑菌活性較低。

3 討論和結(jié)論

本研究從甘草根中分離得到6個(gè)化合物，衍生化得到3個(gè)化合物。依據(jù)結(jié)構(gòu)類型特征，上述9個(gè)化合物分為3種類型：4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定為異黃酮類化合物，異甘草素、4，4′-O-二乙酰基異甘草素和4-O-乙?；惛什菟貫椴闋柾惢衔?，甘草素、甘草苷和4′-O-乙酰基甘草素為黃酮類化合物。

從抑菌活性可以看出，4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定對(duì)大部分供試植物病原菌都有較好的抑菌活性；異甘草素僅對(duì)植物病原細(xì)菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性；4，4′-O-二乙?；惛什菟貙?duì)植物病原細(xì)菌具有一定的抑菌活性；4-O-乙?；惛什菟爻龑?duì)植物病原細(xì)菌具有抑菌活性外，對(duì)部分供試植物病原真菌也具有一定的抑菌活性；其他化合物對(duì)植物病原菌無(wú)抑菌活性或抑菌活性較弱。

4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定為光甘草定或其類似物，具有異黃酮類化合物母核結(jié)構(gòu)。在所有供試化合物中，光甘草定的抑菌活性最強(qiáng)，4′-O-甲基光甘草定的抑菌活性次之，二者對(duì)部分植物病原真菌的抑菌活性顯著優(yōu)于對(duì)照藥劑甲基硫菌靈或與之相當(dāng)；hispaglabridin B雖然也具有廣譜的抑菌活性，但其抑菌活性總體上低于4′-O-甲基光甘草定和光甘草定，以上數(shù)據(jù)表明異黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中B環(huán)上取代基結(jié)構(gòu)增大，可導(dǎo)致其抑菌活性降低。此外，楊春平等[8]發(fā)現(xiàn)，光甘草定對(duì)姜瘟病菌(Ralstoniasolanacearum)、番茄青枯病菌(Pseudomonassolanacearum)、大白菜軟腐病菌(Erwinacarotovora)和獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)等植物病原細(xì)菌具有強(qiáng)烈的抑菌作用，對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、稻瘟病菌和茶葉炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等植物病原真菌或卵菌的孢子萌發(fā)也具有強(qiáng)烈的抑制活性，與本研究的結(jié)果互為補(bǔ)充。何橋[12]合成了光甘草定類似物，發(fā)現(xiàn)部分類似物在高濃度時(shí)對(duì)姜瘟病菌、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)和西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)等植物病原菌有一定的抑制作用。上述研究結(jié)果顯示：光甘草定及其類似物具有開(kāi)發(fā)成生物農(nóng)藥的潛力。

異甘草素、4，4′-O-二乙?；惛什菟睾?-O-乙酰基異甘草素為異甘草素或其衍生物，具有查爾酮類化合物母核結(jié)構(gòu)，其抑菌活性總體上弱于光甘草定及其類似物。然而，異甘草素雖然對(duì)供試植物病原真菌未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，但是對(duì)供試植物病原細(xì)菌具有較高的抑菌活性，與對(duì)照藥劑噻枯唑無(wú)顯著差異，并且明顯優(yōu)于其他8個(gè)黃酮類化合物，說(shuō)明異甘草素具有開(kāi)發(fā)成植物細(xì)菌病害防治藥劑的潛力。4，4′-O-二乙?；惛什菟乇M管保留了對(duì)水稻白葉枯病菌的抑菌活性，但抑菌活性較異甘草素明顯下降。與異甘草素相比，4-O-乙?；惛什菟貙?duì)水稻白葉枯病菌的抑菌活性有所下降，但對(duì)水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌卻表現(xiàn)出一定的抑菌活性。上述研究結(jié)果顯示：在查爾酮類化合物的A、B環(huán)上引入取代基，會(huì)導(dǎo)致其抑菌活性降低。其原因可能是該化合物經(jīng)乙?；?，分子體積變大，在與靶點(diǎn)作用時(shí)，較大的取代基團(tuán)不利于化合物深入靶點(diǎn)的活性腔，從而減弱化合物與靶點(diǎn)的作用，進(jìn)而減弱抑菌活性。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)甘草素、甘草苷和4′-O-乙?；什菟卦?0 μg·mL-1時(shí)對(duì)所有供試病原菌的抑菌活性較弱。

綜合3個(gè)類型化合物的抑菌活性，對(duì)植物病原真菌的抑制效果由高到低依次為異黃酮類化合物、查爾酮類化合物、黃酮類化合物，對(duì)植物病原細(xì)菌(水稻白葉枯病菌)的抑制效果由高到低依次為查爾酮類化合物、異黃酮類化合物、黃酮類化合物。

綜上所述，從甘草中分離得到的4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定對(duì)供試植物病原菌具有廣譜的抑菌活性，可作為新型生物農(nóng)藥先導(dǎo)化合物進(jìn)行開(kāi)發(fā)，異甘草素對(duì)供試細(xì)菌水稻白葉枯病菌具有較好的抑菌活性，可作為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)細(xì)菌病害防治藥劑。