賈麗麗， 尹 蓮， 劉潔霞， 王 昊， 沈 迪， 馮 凱， 熊愛生，①

(南京農(nóng)業(yè)大學： a. 園藝學院， b. 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，c. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 江蘇 南京 210095)

芹菜(ApiumgraveolensLinn.)，也即旱芹，隸屬于傘形科(Apiaceae)芹屬(ApiumLinn.)[1]，是重要的葉菜類蔬菜作物之一。芹菜屬于冷涼性蔬菜，最適種植溫度為15 ℃～ 20 ℃[2]，溫度是影響芹菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因子之一，高溫和低溫均會引發(fā)如燒心、空心和葉柄開裂等常見病害，進而影響芹菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。干旱和高鹽等非生物脅迫也會對芹菜的產(chǎn)量和品質(zhì)有較大的影響。

萜類化合物種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，是植物次生代謝產(chǎn)物中種類最多的一類[3]，在植物生長發(fā)育調(diào)控和響應(yīng)外界環(huán)境脅迫時有重要作用[4-6]。在生物和非生物脅迫下，萜類化合物均可被誘導(dǎo)以啟動防御反應(yīng)。例如：在高溫條件下，冬青櫟(QuercusilexLinn.)利用單萜清除細胞內(nèi)的自由基團和活性氧等，同時產(chǎn)生大量的揮發(fā)性單萜降低樹體溫度以減少高溫傷害[7]；在氧化脅迫下，單萜還可通過降低臭氧含量緩解氧化傷害[8]。萜類化合物是傘形科植物揮發(fā)油的主要組成成分之一，其在植物防御非生物脅迫過程中的作用為傘形科植物抗逆性研究提供了新的方向和思路。

檸檬烯是萜類化合物中結(jié)構(gòu)最簡單的環(huán)狀功能單萜，是許多環(huán)狀萜類化合物形成的前體物質(zhì)。已有研究表明：檸檬烯合酶可作為研究環(huán)狀單萜合酶的模式酶[9]。自1993年Colby等[10]從留蘭香(MenthaspicataLinn.)中克隆獲得第1個檸檬烯合酶基因(LIMS基因)以來，研究者陸續(xù)從水稻(OryzasativaLinn.)、薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)和雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)等植物中克隆獲得檸檬烯合酶基因，并對其功能進行了初步研究[11-13]。而芹菜中檸檬烯合酶基因的功能和表達特性，以及在非生物脅迫條件下該基因在芹菜抗逆性誘導(dǎo)和調(diào)控中的作用，人們尚未有清晰的了解。

鑒于此，作者以芹菜品種‘六合黃心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)和‘津南實芹’(‘Jinnan Shiqin’)為研究對象，克隆獲得其LIMS基因，并采用生物信息學分析方法對該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進行分析；采用qRT-PCR技術(shù)檢測該基因的相對表達量在不同組織及不同脅迫條件下的變化，為進一步研究芹菜對逆境脅迫的抗性機制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’的種子均保存于南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室傘形科蔬菜作物實驗室。

于2019年2月將種子播種并置于人工氣候生長室內(nèi)，參照文獻[14]設(shè)置培養(yǎng)條件，待幼苗長至2月齡時，分別取近植株頂部的3或4枚葉片(莖葉)以及葉柄(中上部)和根各0.5 g，立即用液氮速凍并保存于-80 ℃冰箱中，用于總RNA提取、cDNA合成及基因表達分析，取樣設(shè)置3個生物學重復(fù)。參照文獻[14]的實驗設(shè)計，并采用相同的培養(yǎng)條件，對2月齡苗分別進行低溫(4 ℃)、高溫(38 ℃)、干旱(質(zhì)量體積分數(shù)20%PEG6000)和高鹽(0.2 mol·L-1NaCl)處理，處理24 h；每處理5盆，每盆6株，共30株；分別在處理0(CK)、1、2、4、8和24 h時，取近植株頂部的3或4枚葉片，立即用液氮速凍并保存于-80 ℃冰箱中，用于qRT-PCR分析，采樣時每處理設(shè)置3個生物學重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 分別取2個芹菜品種的葉片，用RNAsimple Total RNA Kit 總RNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取總RNA，并用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體操作過程見試劑盒說明書。

1.2.2 基因克隆 基于芹菜轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫[15-16]，檢索獲得AgLIMS基因；根據(jù)該基因序列分別設(shè)計正向引物(5′-ATGGCTCTTGCATCCTCTTCTCAGA-3′)和反向引物(5′-TTATCTATCATTCCCAATAAGAGTT-3′)。PCR擴增體系總體積20.0 μL，包括PrimeSTAR Max Premix〔寶生物工程(大連)有限公司〕10.0 μL、雙蒸水7.0 μL、5 mmol·L-1cDNA模板1.0 μL及10 μmol·L-1的正向和反向引物各1.0 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物交由南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 采用BioXM 2.6軟件對克隆獲得的AgLIMS基因進行序列分析；采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTp工具對AgLIMS基因編碼的氨基酸序列的保守域進行預(yù)測，并獲得其他植物LIMS基因編碼的氨基酸序列；采用DNAMAN 6.0軟件對AgLIMS基因與其他植物LIMS基因編碼的氨基酸序列進行多重比對，并進行親水性和疏水性分析；采用MEGA 5.2軟件繪制AgLIMS基因與其他植物LIMS基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹；使用ExPASY數(shù)據(jù)庫和序列處理在線工具包(SMS)(http：∥www.bio-soft.net/sms/)分析AgLIMS蛋白的理論相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和理論等電點等；通過SOPMA網(wǎng)站(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對AgLIMS蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行在線預(yù)測；通過CPHmodels 3.2網(wǎng)站(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)在線建立AgLIMS蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。

1.2.4 qRT-PCR分析 根據(jù)AgLIMS基因測序結(jié)果，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計熒光定量引物，正向引物序列為5′-TTGGTGGAGGCTCGGTGGTT-3′，反向引物序列為5′-TGCTTCATCACTGCTGCCCATTT-3′；以芹菜actin基因作為內(nèi)參基因[17]，使用qRT-PCR檢測系統(tǒng)分析AgLIMS基因的表達水平。反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包括10 μmol·L-1的正向和反向引物各0.4 μL、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司) 10.0 μL、雙蒸水7.2 μL和5 mmol·L-1cDNA模板 2.0 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s、55 ℃～60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[18]計算AgLIMS基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

用EXCEL 2010和SPSS 24.0軟件對AgLIMS基因的相對表達量數(shù)據(jù)進行整理分析，采用單因素方差分析法和Duncan’s多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 AgLIMS基因的克隆和測序結(jié)果

克隆和測序結(jié)果顯示：AgLIMS基因的開放閱讀框長1 800 bp，編碼599個氨基酸。芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’AgLIMS基因核苷酸序列有2個堿基位點的差異，分別為第954位的C和A以及第1 693位的A和G(圖1)，核苷酸序列的差異導(dǎo)致其編碼的氨基酸位點發(fā)生改變，分別為第318位的絲氨酸(Ser)和精氨酸(Arg)以及第565位天冬酰胺(Asn)和天冬氨酸(Asp)。保守域預(yù)測結(jié)果(圖2)顯示：AgLIMS基因編碼的氨基酸序列在第50至第586位存在植物萜類合酶(Terpene cyclase plant C1)保守區(qū)域，具有典型的類異戊二烯合成酶(Isoprenoid Biosyn C1)超家族結(jié)構(gòu)域。

2.2 AgLIMS基因編碼的氨基酸序列的生物信息學分析

2.2.1 同源性比對和系統(tǒng)進化分析 芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’AgLIMS基因與其他13種植物LIMS基因編碼的氨基酸序列的多重比對及系統(tǒng)進化分析結(jié)果分別見圖3和圖4。多重比對結(jié)果(圖3)顯示：AgLIMS基因與其他植物LIMS基因編碼的氨基酸序列一致性為61.33%，且均含有萜類合酶氨基酸序列的2個高度保守域RRX8W和DDXXD。

方框內(nèi)序列為有差異的核苷酸位點及對應(yīng)的氨基酸位點The sequences in the boxes are different nucleotide sites and corresponding amino acid sites. *： 終止密碼子Stop codon.

圖2 芹菜AgLIMS基因編碼的氨基酸序列的保守域預(yù)測結(jié)果

在系統(tǒng)進化樹(圖4)上，2個芹菜品種首先聚在一起，并與同科種類細葉糙果芹〔Trachyspermumammi(Linn.) Sprague〕聚在同一小分支中，與同科植物胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)聚在同一大分支中，說明同科植物的進化關(guān)系較近；而與其他科木本種類，如棗(ZiziphusjujubaMill.)、歐洲栓皮櫟(QuercussuberLinn.)、胡桃(JuglansregiaLinn.)和木槿(HibiscussyriacusLinn.)等的進化關(guān)系較遠。

方框內(nèi)序列為保守域The sequences in the box are conserved domains； 黑色表示同一位點的氨基酸完全一致，白色表示同一位點的氨基酸不完全一致Black indicates the amino acids at the same site are completely identical， and white indicates the amino acids at the same site are not completely identical.

Ac： 中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.； Cs： 茶樹Camellia sinensis (Linn.) Kuntze； Vv： 葡萄Vitis vinifera Linn.； Qs： 歐洲栓皮櫟Quercus suber Linn.； Ql： 加州白櫟Quercus lobata Née； Jr： 胡桃Juglans regia Linn.； Zj： 棗Ziziphus jujuba Mill.； Me： 木薯Manihot esculenta Crantz； Pe： 胡楊Populus euphratica Oliv.； Cj： 金柑Citrus japonica Thunb.； Hs： 木槿Hibiscus syriacus Linn.； Ag1： ‘六合黃心芹’‘Liuhe Huangxinqin’； Ag2： ‘津南實芹’‘Jinnan Shiqin’； Dc： 胡蘿卜Daucus carota var. sativa Hoffm.； Ta： 細葉糙果芹Trachyspermum ammi (Linn.) Sprague.

2.2.2 氨基酸組成和理化性質(zhì)分析 芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’AgLIMS蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)見表1，該蛋白的親水性和疏水性見圖5。

由表1可見：2個芹菜品種的AgLIMS蛋白均由599個氨基酸組成，理論相對分子質(zhì)量分別為69 120和69 190，理論等電點均為pI 5.52；二者的總平均疏水性略有差異，分別為-0.263和-0.269；2個芹菜品種的AgLIMS蛋白的酸性、堿性、脂肪族和芳香族氨基酸所占比例均相同，表明這2個芹菜品種的AgLIMS蛋白的相似度極高。此外，組成AgLIMS蛋白的氨基酸中，酸性氨基酸與堿性氨基酸的比例相同，均為14%，表明AgLIMS蛋白為中性蛋白。

由圖5可見：在AgLIMS蛋白的親水性區(qū)域，第461位的谷氨酸(Glu)的親水性最強；在該蛋白的疏水性區(qū)域，第551位的亮氨酸(Leu)的疏水性最強。組成AgLIMS蛋白的氨基酸中，親水性氨基酸所占比例為58.3%，疏水性氨基酸所占比例為41.7%，據(jù)此推測AgLIMS為親水性蛋白。

2.2.3 蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 對2個芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’AgLIMS蛋白級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示：在‘六合黃心芹’和‘津南實芹’的AgLIMS蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋分別占65.94%和65.78%，延伸鏈分別占2.84%和3.17%、β轉(zhuǎn)角分別占3.17%和3.01%，無規(guī)則卷曲分別占28.05%和28.05%，2個芹菜品種間差異不明顯；總體來說，AgLIMS蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。

表1 2個芹菜品種AgLIMS蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)

圖5 芹菜AgLIMS蛋白的親水性(A)和疏水性(B)

三級結(jié)構(gòu)模型(圖6)顯示：‘六合黃心芹’和‘津南實芹’的AgLIMS蛋白三級結(jié)構(gòu)均含有1個β折疊，但2個芹菜品種AgLIMS蛋白三級結(jié)構(gòu)中α螺旋數(shù)量有差異，‘六合黃心芹’含25個α螺旋，‘津南實芹’含23個α螺旋。

圖6 芹菜品種‘六合黃心芹’(A)和‘津南實芹’(B)的AgLIMS蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.3 AgLIMS基因表達特性的差異和變化

2.3.1 在不同組織中相對表達量的差異 在芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’不同組織中AgLIMS基因的相對表達量差異見表2。結(jié)果顯示：AgLIMS基因在2個芹菜品種葉片、葉柄和根中均有表達，但相對表達量存在顯著(P<0.05)差異，均表現(xiàn)為在葉片中最高、在葉柄中次之、在根中最低。在‘六合黃心芹’葉片和根中AgLIMS基因的相對表達量顯著高于‘津南實芹’，但在其葉柄中AgLIMS基因的相對表達量與后者無顯著差異。

2.3.2 非生物脅迫條件下相對表達量的變化 在非生物脅迫條件下芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’AgLIMS基因相對表達量的變化見表3。

在高溫(38 ℃)條件下處理1～24 h，‘六合黃心芹’和‘津南實芹’AgLIMS基因的相對表達量總體隨處理時間的延長呈波動升高的趨勢，在處理24 h達到最大值，分別為處理0 h的10.5和8.1倍，且差異顯著。

表2 2個芹菜品種不同組織中AgLIMS基因相對表達量的比較

在低溫(4 ℃)條件下處理1～24 h，‘六合黃心芹’AgLIMS基因的相對表達量呈小幅波動變化，但總體無顯著差異?！蚰蠈嵡邸疉gLIMS基因的相對表達量則隨處理時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，總體差異顯著；在處理4 h達到最大值(為處理0 h的2.5倍)，在處理24 h降至最低(較處理0 h降低51.5%)。

在干旱(質(zhì)量體積分數(shù)20%PEG6000)條件下處理1～24 h，‘六合黃心芹’AgLIMS基因的相對表達量在處理0～4 h內(nèi)無顯著變化，但之后急劇上升，且在處理24 h達到最大值，為處理0 h的16.8倍?！蚰蠈嵡邸疉gLIMS基因的相對表達量則隨處理時間的延長呈波動升高的變化趨勢，且與處理0 h差異顯著；其中，在處理1～8 h小幅波動，但在處理24 h急劇升高并達到最大值，為處理0 h的30.7倍。

在高鹽(0.2 mol·L-1NaCl)條件下處理1～24 h，‘六合黃心芹’AgLIMS基因的相對表達量隨處理時間的延長呈先升高后波動降低的變化趨勢，其中，在處理1和2 h顯著升高，分別為處理0 h的6.9和2.8倍；而在處理4～24 h降低，且與處理0 h無顯著差異。‘津南實芹’AgLIMS基因的相對表達量則隨處理時間的延長呈波動升高的變化趨勢，且與處理0 h差異顯著，在處理24 h達到最大值，為處理0 h的14.3倍。

表3 非生物脅迫條件下2個芹菜品種AgLIMS基因相對表達量的變化

3 討論和結(jié)論

檸檬烯合酶基因在植物中普遍存在，但不同植物種類的檸檬烯合酶基因序列差異較大，且功能存在差異。本研究從芹菜品種‘六合黃心芹’和‘津南實芹’中均克隆獲得芹菜檸檬烯合酶基因AgLIMS，但2個芹菜品種的AgLIMS基因堿基序列存在2個位點的差異，進而使其編碼的氨基酸序列也存在2個位點差異，這種差異可能與栽培地的環(huán)境條件差異以及品種間的遺傳差異有關(guān)，但環(huán)境因子對該基因功能的影響尚不清楚，還需進一步深入研究。此外，多重比較和系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示：同科植物LIMS基因編碼的氨基酸序列遺傳一致性較高，且在系統(tǒng)樹上首先聚在一起，說明同科植物的LIMS蛋白親緣關(guān)系更近，且該基因編碼的氨基酸序列具有一定的保守性。

檸檬烯合酶在甜橙〔Citrussinensis(Linn.)Osbeck〕、水稻和薄荷等植物中廣泛存在[19-21]，且在植物中呈不均衡分布。CitrusunshiuMarc.中檸檬烯合酶基因CitMTSE1在花中特異性表達[22]。本文研究也發(fā)現(xiàn)AgLIMS基因在‘六合黃心芹’和‘津南實芹’不同組織中表達存在較大差異，在葉片中的相對表達量顯著高于葉柄和根，具有明顯的組織特異性。

高溫、低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫對芹菜產(chǎn)量和品質(zhì)均有不同程度的影響[23]。萜類化合物作為植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，能夠直接或間接參與植物的防御反應(yīng)[24]。高溫可誘導(dǎo)冬青櫟釋放大量的單萜[7]；干旱處理下，與玉米(ZeamaysLinn.)抗逆性相關(guān)的2個倍半萜合酶基因ZmTPS6和ZmTPS8的表達量在玉米品種‘Mo17’中上升，而在品種‘B73’中下調(diào)[25]；對擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中控制合成萜類化合物的直接前體物質(zhì)法尼基焦磷酸基因進行沉默處理會導(dǎo)致擬南芥非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控失常[26]。這些研究結(jié)果均表明植物在受到生物與非生物脅迫時會釋放單萜和倍半萜等揮發(fā)性物質(zhì)進行間接防御，同時誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達。在本研究中，對2個芹菜品種進行高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(質(zhì)量體積分數(shù)20%PEG6000)和高鹽(0.2 mol·L-1NaCl)脅迫處理，2個芹菜品種的AgLIMS基因均有不同程度的表達，但相對表達量隨處理時間延長呈現(xiàn)不同的變化趨勢；總體上看，在4種非生物脅迫處理下‘津南實芹’的AgLIMS基因相對表達量不同程度升高；而‘六合黃心芹’的AgLIMS基因相對表達量在高溫和干旱脅迫下顯著升高，但經(jīng)低溫和高鹽處理后變化幅度不大。表明芹菜在受到非生物脅迫時其AgLIMS基因參與對逆境脅迫的生理響應(yīng)，但該響應(yīng)效應(yīng)存在品種間差異[27]。

綜合分析結(jié)果表明：從芹菜不同品種中均能克隆獲得AgLIMS基因，但不同品種間該基因的序列及其編碼的氨基酸序列略有差異；該基因與同科植物的LIMS基因具有較高的一致性。AgLIMS基因在芹菜不同組織中均有表達，但在葉片中相對表達量較高；經(jīng)過高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫處理后，AgLIMS基因的表達特性發(fā)生變化，但2個芹菜品種AgLIMS基因的表達特性存在差異。表明該基因在芹菜抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但AgLIMS基因的表達特性存在組織特異性和品種差異性。

本文通過對芹菜AgLIMS基因的克隆和生物信息學分析及其表達特性的研究，為明確萜類合酶基因在芹菜逆境響應(yīng)中的作用提供了依據(jù)。但植物對非生物脅迫的響應(yīng)機制相互關(guān)聯(lián)且非常復(fù)雜，僅研究其中某個基因無法全面闡述植物響應(yīng)逆境脅迫的調(diào)控途徑和代謝機制，因而，后續(xù)將擴大芹菜品種數(shù)量，針對多個與植物抗逆性相關(guān)的基因開展深入研究。