唐千惠, 王佳欣, 孫 康,c, 曾 亮,c, 吳致君,c,①
(西南大學: a. 食品科學學院, b. 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心, c. 茶葉研究所, 重慶 400715)
茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn.),為多年生常綠木本植物,是中國重要的葉類經(jīng)濟作物。茶葉中富含茶多酚、茶氨酸和咖啡堿等物質(zhì),在抗癌、抗衰老、抗炎癥和預防心腦血管疾病等方面發(fā)揮一定作用[1-2]。茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)與茶樹的生長環(huán)境密切相關,光照是其重要的影響條件之一。如:采摘前適當遮光可提高茶葉中茶氨酸等鮮爽類物質(zhì)含量,降低黃酮等苦澀味物質(zhì)含量;長日照條件可延長茶芽可采周期;光質(zhì)的差異化可影響茶葉多酚類和香氣組分[3-5]。目前,盡管憑借種植經(jīng)驗可通過改變光照環(huán)境調(diào)節(jié)茶樹的生長,但茶樹受光調(diào)控機制不明確阻礙了園藝措施精細化和育種定向化[6-7]。
植物中存在一系列的光受體,如光敏色素(phytochromes,PHYs)、向光素(phototropins,PHOTs)、隱花色素(cryptochromes,CRYs)和紫外抗性位點8(UV resistance locus 8,UVR8),通過感知光質(zhì)特征和光的強弱以及改變光周期調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的適應性[8-9]。研究表明:茶樹在光照環(huán)境中的發(fā)育和代謝受到光受體的調(diào)控[3-4,10]。因此,進一步開展茶樹光受體基因研究對于茶園園藝措施改進和茶樹品種改良具有重要意義。
隱花色素是一種類似于光裂解酶的藍光/近紫外光的光受體蛋白[11-12]。植物中的Plant CRY和CRY-DASH類隱花色素屬于光裂解酶/隱花色素超級家族(photolyase/cryptochrome superfamily)[13]。有關植物中Plant CRY類隱花色素的研究較多,其生物學功能較為明確[13]。Plant CRY類隱花色素具有N端的光裂解酶同源區(qū)域(photolyase homology region,PHR)以及長度和序列多變的C端隱花色素延伸域(cryptochrome C-terminal extension,CCE)2個結(jié)構(gòu)域[11,13]。Plant CRY類隱花色素通過傳導藍光信號調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和物質(zhì)代謝,如抑制下胚軸生長[14]、開花[15]、氣孔發(fā)育[16]、子葉發(fā)育[17]和類黃酮合成[18]等。目前,Plant CRY類隱花色素基因已在多種植物中被分離和鑒定,如擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[14]、水稻(OryzasativaLinn.)[19]、小麥(TriticumaestivumLinn.)[20]、番茄(SolanumlycopersicumLinn.)[21]、高粱〔Sorghumbicolor(Linn.) Moench〕[22]、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)[23]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[24]和胡楊(PopuluseuphraticaOliv.)[25]等。Liu等[3]和Zheng等[4]利用茶樹轉(zhuǎn)錄組和代謝組對其受單色光調(diào)控的機制進行了研究,結(jié)果顯示:藍光促進茶葉中多酚類物質(zhì)的積累,推測這可能與隱花色素基因介導調(diào)控有關。然而,茶樹中隱花色素基因尚未被克隆鑒定,其生物學功能還需進一步研究。
本研究通過同源序列比對茶樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26-27],克隆到2個茶樹隱花色素基因,對其編碼蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化關系、二級結(jié)構(gòu)和PHR結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)進行了生物信息學分析,對這2個基因啟動子的順式作用元件進行了預測分析,并利用實時熒光定量PCR技術分析了這2個隱花色素基因在不同組織以及不同光照和激素處理下的表達模式,較為系統(tǒng)地闡述了茶樹隱花色素結(jié)構(gòu)和功能特征,以期為進一步開展其在光照環(huán)境中網(wǎng)絡調(diào)控作用機制的研究提供幫助。
供試材料為茶樹品種‘福鼎大白茶’(‘Fuding Dabaicha’)1年生扦插苗,購自南京雅潤茶葉有限公司。
1.2.1 處理方法 于2020年4月選取長勢一致的茶樹幼苗種植于花盆(直徑16.5 cm,高17.5 cm)中,栽培基質(zhì)為體積比1∶1的草泥土和蛭石,然后置于RDN-300B-4人工氣候光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)中,培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照時間16 h·d-1、光照強度180 μmol·m-2·s-1,白光。培養(yǎng)2周后,用于后續(xù)實驗。
組織表達分析:分別選用茶樹幼苗頂部向下數(shù)第3枚葉片、嫩莖、花和嫩根。
光照處理:將茶樹幼苗分別置于白光、黑暗、藍光和紅光的培養(yǎng)箱中,分別于處理0和4 h采摘頂部向下數(shù)第3枚葉片。每個處理3個生物學重復,每個重復3株。實驗用光源(白光、紅光和藍光)均為LED燈,光照強度均為180 μmol·m-2·s-1,其他培養(yǎng)條件與前期培養(yǎng)條件一致。
激素處理:將茶樹幼苗置于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件與前期培養(yǎng)條件一致。設置0.1 mmol·L-1脫落酸(ABA)、1.0 mmol·L-1吲哚乙酸(IAA)、1.0 mmol·L-1赤霉素(GA3)和1.0 mmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)4個激素處理,其中,ABA用蒸餾水配制,IAA、GA3和MeJA用體積分數(shù)2%乙醇配制。ABA處理以等體積蒸餾水為對照,IAA、GA3和MeJA處理以等體積的體積分數(shù)2%乙醇為對照。每個處理3個生物學重復,每個重復3株。每株幼苗葉片正、反面一次性均勻噴灑20 mL處理液,分別于處理0、4、12和24 h采摘頂部向下數(shù)第3枚葉片。
所有樣品采摘后迅速浸入液氮中,然后置于-80 ℃冰箱保存,備用。
1.2.2 總RNA提取、cDNA合成及基因克隆 按照Quick RNA Isolation Kit試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)操作說明提取葉、莖和花中總RNA,根中總RNA提取采用Trizol提取法。采用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。使用Primer premier 5.0軟件設計CsCRY1和CsCRY2基因的克隆引物,其中,CsCRY1-CF引物序列為5′-ATGTCAGGACGTGGGTGTAGCATAG-3′,CsCRY1-CR引物序列為5′-TTACCCAGTTTGAGAAAGCCGCCTC-3′;CsCRY2-CF引物序列為5′-ATGGGTAGCAATTCAAAAACCATTG-3′,CsCRY2-CR引物序列為5′-TTAACCTCCCACAGCTCCATTTTTG-3′。CsCRY1基因的PCR擴增體系總體積為50 μL,包括金牌Mix(green)(北京擎科生物科技有限公司)45 μL,10 μmol·L-1CsCRY1-CF和CsCRY1-CR引物各2 μL,1 ng·μL-1模板cDNA 1 μL;CsCRY2基因的PCR擴增體系總體積為50 μL,包括金牌Mix(green)45 μL,10 μmol·L-1CsCRY2-CF和CsCRY2-CR引物各2 μL,1 ng·μL-1模板cDNA 1 μL?;驍U增模板cDNA來自光照處理0 h葉片。擴增程序為:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s,30個循環(huán);72 ℃延伸1 min。用1.2 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。采用pClone007平末端載體連接PCR產(chǎn)物(北京擎科生物科技有限公司),然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,挑取單克隆,培養(yǎng)、鑒定后送至北京擎科生物科技有限公司測序。
1.2.3 生物信息學分析 基于茶樹基因組和轉(zhuǎn)錄組[26-27],通過擬南芥AtCRY1(登錄號AT4G08920)和AtCRY2(登錄號AT1G04400)基因堿基序列進行同源序列比對,檢索茶樹隱花色素基因。BLASTn和BLASTp序列檢索在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和BioEdit軟件中完成。使用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列比對。采用MEGA 5.1軟件中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用SOPMA(https:∥prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)在線軟件預測CsCRY1和CsCRY2蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)在線軟件預測CsCRY1和CsCRY2蛋白PHR結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)。利用PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件分析CsCRY1和CsCRY2基因上游1 500 bp內(nèi)啟動子順式作用元件。
1.2.4 基因的表達模式分析 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)在CFX96TMReal-Time System(美國Bio-Rad公司)上進行。設計用于CsCRY1基因檢測的CsCRY1-JF引物序列為5′-TAGGGCTGAAGTGCCAACGAATGTC-3′,CsCRY1-JR引物序列為5′-TGTGGTGGAGTTGCGTTGCTTTGGA-3′;設計用于CsCRY2基因檢測的CsCRY2-JF引物序列為5′-ATCATTGCTGGGAAGCCTGAAACAT-3′,CsCRY2-JR引物序列為5′-GCATCAACCAAAGGGTAACCAGTCC-3′。擴增體系總體積為20.0 μL,包括2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)(北京擎科生物科技有限公司)10.0 μL,10 μmol·L-1正向和反向檢測引物各0.8 μL,0.05 ng·μL-1模板cDNA 2.0 μL和ddH2O 6.4 μL。擴增反應程序為:95 ℃預變性1 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s,40個循環(huán)。
組織表達和光照處理的內(nèi)參基因采用ACT基因,其CsACT-F引物序列為5′-GAGATTCCGTTGCCCTGAAGTCCTG-3′,CsACT-R引物序列為5′-TCCTTGCTCATACGGTCTGCGATAC-3′;激素處理內(nèi)參基因采用TBP,其CsTBP-F引物序列為5′-GGCGGATCAAGTGTTGGAAGGGAG-3′,CsTBP-R引物序列為5′-ACGCTTGGGATTGTATTCGGCATTA-3′[28]。采用Pfaffl[29]的方法計算基因的相對表達水平。
經(jīng)序列同源比對,在茶樹中獲得2個隱花色素基因,登錄號分別為CSS0033306.1和CSS0018720.1。根據(jù)這2個基因序列設計克隆引物,以茶樹品種‘福鼎大白茶’cDNA為模板,擴增獲得2條長度約2 000 bp的明亮條帶(圖1)。經(jīng)切膠回收和連接轉(zhuǎn)化后測序,測序結(jié)果與預測結(jié)果一致,將2個基因分別命名為CsCRY1和CsCRY2。CsCRY1基因的開放閱讀框長度為2 055 bp,編碼684個氨基酸;CsCRY2基因的開放閱讀框長度為1 944 bp,編碼647個氨基酸。CsCRY1和CsCRY2基因堿基序列的相似度較低,一致性為55.30%。與茶樹基因組比對,CsCRY1基因序列包含4個外顯子和3個內(nèi)含子,CsCRY2基因序列包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。
2.2.1 功能結(jié)構(gòu)域分析 利用DNAMAN 6.0軟件進行序列比對,發(fā)現(xiàn)茶樹CsCRY1蛋白與擬南芥AtCRY1蛋白(登錄號AAB28724)氨基酸序列的一致性為75.97%,CsCRY2蛋白與AtCRY2蛋白(登錄號NP_849588)氨基酸序列的一致性為61.54%。CsCRY1和CsCRY2蛋白氨基酸序列的N端最為保守,具有明顯的PHR結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與擬南芥對應氨基酸序列的一致性較高(圖2-A)。此外,CsCRY1和CsCRY2蛋白氨基酸序列的C端均具有CCE結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與擬南芥對應氨基酸序列的差異較大(圖2-A)。
M: DL5000 DNA marker; 1: CsCRY1基因CsCRY1 gene; 2: CsCRY2基因CsCRY2 gene.
截取CCE結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列片段重新進行比對,發(fā)現(xiàn)CsCRY1和CsCRY2蛋白的氨基酸序列均含有保守的DAS(DQXVP-Acidic-SXAESSS)基序(圖2-B)。
上述研究結(jié)果表明:茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白可能具有與擬南芥中相似的藍光信號調(diào)控機制。
2.2.2 系統(tǒng)進化分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取了滇山茶(CamelliareticulataLindl.)、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)、蘋果〔Malusdomestica(Suckow) Borkh.〕、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et A. Gray ex Hook.)、擬南芥、可可(TheobromacacaoLinn.)、葡萄(VitisviniferaLinn.)、水稻、節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.)和玉米(ZeamaysLinn.)10種植物以及石果衣真菌(Endocarponpusillum)的光裂解酶/隱花色素超級家族成員序列,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果(圖3)顯示:在光裂解酶/隱花色素超級家族中,茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白與其他10種植物和石果衣真菌中的家族成員分為6個亞族,分別是Plant PHR2、 CRY-DASH、 (6-4)PHR、 Plant CRY、 CPD class Ⅰ PHR和CPD class Ⅱ PHR。CsCRY1和CsCRY2蛋白被分在了Plant CRY亞族中,說明茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白屬于Plant CRY類隱花色素。Plant CRY亞族包括Plant CRY1和Plant CRY2 2個分支,CsCRY1和CsCRY2蛋白分別分布于這2個分支。在進化樹分支距離上,茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白與滇山茶和中華獼猴桃較近,與單子葉植物較遠。
色塊顏色越深表示相似度越高The darker the color blocks, the higher the similarity.
2.2.3 二級和三級結(jié)構(gòu)分析 利用SOPMA在線軟件對茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進行預測,結(jié)果(圖4)顯示:CsCRY1蛋白中無規(guī)則卷曲(random coil)(43.13%)和α螺旋(α-helix)(41.96%)所占比例較高,β折疊(β-sheet)(9.21%)和β轉(zhuǎn)角(β-turn)(5.70%)所占比例較低;CsCRY2蛋白中也是無規(guī)則卷曲(48.84%)和α螺旋(37.71%)所占比例較高,β折疊(8.96%)和β轉(zhuǎn)角(4.48%)所占比例較低。
以擬南芥AtCRY1的PHR晶體結(jié)構(gòu)1u3d.1.A為參照模型,利用SWISS-MODEL在線軟件預測茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白PHR結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu),結(jié)果(圖5)顯示:茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白的PHR結(jié)構(gòu)域與參照模型相似,主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲和β折疊組成,且在N端具有α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)域,與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相吻合。
分支上數(shù)據(jù)代表自展值The datums on the branches represent the bootstrap values. Cr: 滇山茶Camellia reticulata Lindl.; Cs: 茶樹Camellia sinensis (Linn.) Kuntze; Ac: 中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.; Vv: 葡萄Vitis vinifera Linn.; Pt: 毛果楊Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.; Tc: 可可Theobroma cacao Linn.; Md: 蘋果Malus domestica (Suckow) Borkh.; At: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.; Ata: 節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii Coss.; Os: 水稻Oryza sativa Linn.; Zm: 玉米Zea mays Linn.; Ep: 石果衣真菌Endocarpon pusillum.
: α螺旋α-helix; : β折疊β-sheet; : β轉(zhuǎn)角β-turn; : 不規(guī)則卷曲Random coil.
圖5 茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白PHR結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)預測
2.2.4 啟動子順式作用元件預測分析 利用PlantCARE軟件對茶樹CsCRY1和CsCRY2基因上游1 500 bp內(nèi)啟動子順式作用元件進行預測分析,結(jié)果分別見表1和表2。
由表1可見:茶樹CsCRY1基因上游1 500 bp區(qū)域中主要含60個核心啟動子元件(TATA-box)、28個啟動子增強子區(qū)域元件(CAAT-box)以及多個參與光響應的調(diào)控元件(AT1-motif、G-box、chs-CMA1a、GATA-motif和Box 4)。此外,還包括赤霉素響應元件(P-box)、脫落酸響應元件(ABRE)、低溫響應元件(LTR)和厭氧誘導必需順式作用調(diào)控元件(ARE)等。
表1 茶樹CsCRY1基因啟動子的順式作用元件及其功能預測
表2 茶樹CsCRY2基因啟動子的順式作用元件及其功能預測
由表2可見:在茶樹CsCRY2基因上游1 500 bp區(qū)域中主要含33個啟動子增強子區(qū)域元件(CAAT-box)、25個核心啟動子元件(TATA-box)以及多個參與光響應的調(diào)控元件(ATCT-motif、AE-box和Box 4)。此外,還包括參與茉莉酸甲酯響應的元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、水楊酸響應順式作用調(diào)控元件(TCA-element)、赤霉素響應元件(TATC-box)、干旱誘導的MYB結(jié)合位點(MBS)和厭氧誘導必需順式作用調(diào)控元件(ARE)等。
預測結(jié)果顯示:CsCRY1和CsCRY2基因啟動子均含有參與光響應、赤霉素響應和厭氧誘導的調(diào)控元件。CsCRY1基因啟動子含有特有的參與脫落酸和低溫響應元件,而CsCRY2基因啟動子含有特有的參與茉莉酸甲酯和水楊酸響應元件以及干旱誘導元件。
2.3.1 不同組織中的表達模式 結(jié)果(圖6)顯示:茶樹根中CsCRY1和CsCRY2基因的相對表達水平均最高,葉中的相對表達水平次之,花中的相對表達水平較低,莖中的相對表達水平最低,且不同組織間的相對表達水平差異顯著。
2.3.2 不同光照處理的表達模式 結(jié)果(圖7)顯示:處理4 h,藍光處理下,茶樹CsCRY1和CsCRY2基因的相對表達水平顯著升高。白光、黑暗和紅光處理下,CsCRY1基因的相對表達水平差異不大;白光和紅光處理下,CsCRY2基因的相對表達水平無明顯變化,但較黑暗處理有所降低。
2.3.3 不同激素處理的表達模式 結(jié)果(表3)顯示:不同激素處理茶樹CsCRY1和CsCRY2基因的表達模式基本一致。0.1 mmol·L-1ABA處理下,CsCRY1和CsCRY2基因的相對表達水平呈先升高后降低的變化趨勢,分別于處理12和4 h達到最高;1.0 mmol·L-1GA3和1.0 mmol·L-1MeJA處理下,2個基因的相對表達水平呈先升高后降低的變化趨勢,并于處理12 h達到最高;1.0 mmol·L-1IAA處理下,2個基因的相對表達水呈“升高—降低—升高”的變化趨勢,于處理4 h達到最高。
: CsCRY1基因CsCRY1 gene; : CsCRY2基因CsCRY2 gene.
: CsCRY1基因CsCRY1 gene; : CsCRY2基因CsCRY2 gene.
表3 不同激素處理茶樹CsCRY1和CsCRY2基因的相對表達水平
盡管植物缺少感光器官,但光受體的發(fā)現(xiàn)證明植物具有感知光信號和適應光環(huán)境的能力[30]。植物隱花色素基因最早在擬南芥的hy4突變體中分離獲得,即AtCRY1基因[14]。隨后從擬南芥中陸續(xù)獲得AtCRY2和AtCRY3基因[31-32]。AtCRY1和AtCRY2蛋白屬于Plant CRY類隱花色素,僅存在于植物中,而AtCRY3蛋白屬于CRY-DASH類隱花色素,廣泛分布于原核和真核生物中[13]。本研究以茶樹品種‘福鼎大白茶’為材料,克隆獲得2個隱花色素基因,分別命名為CsCRY1和CsCRY2。序列分析結(jié)果顯示:茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白與擬南芥AtCRY1和AtCRY2蛋白結(jié)構(gòu)相似,其氨基酸序列均在N端有1個光裂解酶同源區(qū)域(PHR),在C端有1個隱花色素延伸域(CCE),屬于Plant CRY類隱花色素典型結(jié)構(gòu)特征[11,13,33],推測CsCRY1和CsCRY2基因為植物特有的保守基因,可能在響應光信號中發(fā)揮重要作用。茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其PHR結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果同樣證明其與擬南芥AtCRY1和AtCRY2蛋白相似。
在植物中,保守的低拷貝基因常用作構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育分類的有效標記[34]。利用茶樹與其他10種植物和真菌構(gòu)建的光裂解酶/隱花色素超級家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,顯示亞族的分支區(qū)別明顯,且Plant CRY類隱花色素的分支與APG Ⅳ系統(tǒng)中綱、目分類相互對應[35],表明隱花色素基因在植物中具有保守度較高且拷貝較低的特點,可用于開發(fā)植物系統(tǒng)發(fā)育分類標記。茶樹CsCRY1和CsCRY2蛋白在系統(tǒng)進化樹中與同目的滇山茶和中華獼猴桃處于同一小分支,這3種植物在植物學分類上同屬于真雙子葉植物中杜鵑花目(Ericales),其中,滇山茶與茶樹最近,二者均隸屬于山茶科,而中華獼猴桃隸屬于獼猴桃科(Actinidiaceae),其植物學分類和基因組進化樹距離與茶樹較近[36],表明Plant CRY類隱花色素構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可用作植物屬的分類標記。Plant CRY類隱花色素的生物學功能在不同植物中有所分化,是否與系統(tǒng)進化樹分支距離有關仍有待考證。如大麥(HordeumvulgareLinn.)HvCRY1a和HvCRY1b基因通過介導表達脫落酸生物合成相關基因來誘導谷物休眠[37];番茄隱花色素介導了番茄紅素在其果實中的積累[38];茶樹隱花色素表達與光處理中多酚形成相關[4]。
隱花色素對于植物根的發(fā)育具有調(diào)控作用,如擬南芥AtCRY1基因通過參與生長素的調(diào)節(jié),促進初生根的延長以及限制側(cè)根的發(fā)育,但AtCRY2基因?qū)Ω鸬揭种谱饔肹18,39]。組織表達結(jié)果顯示:茶樹根中CsCRY1和CsCRY2基因的相對表達水平最高,其后依次為葉、花、莖,推測2個基因可能在茶樹根的發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。該結(jié)果與胡楊PeCRY1基因的組織表達情況相似,PeCRY1基因在根和葉中的表達量最高[25]。此外,有研究表明甘菊〔Chrysanthemumlavandulifolium(Fisch. ex Trautv.) Makino〕根中ClCRY1a/b基因的表達量最低[40],該結(jié)果與茶樹中得到的結(jié)果相反。隱花色素基因的表達與光照條件有關,其在不同植物根中的表達高低不一,推測可能與激素調(diào)節(jié)或者取樣部位有關[25,39]。
茶樹CsCRY1和CsCRY2基因的啟動子順式作用元件預測分析顯示:在上游1 500 bp區(qū)域序列中主要存在多種光響應和激素響應元件,如AT1-motif、Box 4、P-box和TATC-box等元件。藍光條件下,茶樹CsCRY1和CsCRY2基因的相對表達水平顯著提高。擬南芥AtCRY1和AtCRY2基因的轉(zhuǎn)錄和表達不受光條件的調(diào)控,盡管其蛋白通過接受和傳導藍光信號調(diào)節(jié)光適應生理活動[41]??梢?,與擬南芥不同,藍光可能具有引起茶樹CsCRY1和CsCRY2基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白光信號傳導的雙重調(diào)控作用。外源激素ABA、GA3、IAA和MeJA均能引起CsCRY1和CsCRY2基因相對表達水平的上調(diào)。啟動子順式作用元件預測分析表明:ABA響應元件和MeJA響應元件分別為CsCRY1和CsCRY2基因啟動子特有元件,然而ABA和MeJA均能誘導CsCRY1和CsCRY2基因的表達。已有研究結(jié)果表明:光信號和激素信號均處于植物信號調(diào)控網(wǎng)絡中,二者具有協(xié)同作用[42]。其中,隱花色素在光信號傳導中與多種激素共同調(diào)控下胚軸生長、根發(fā)育和避蔭等生物學過程[18,43-44]。在茶樹中,同樣發(fā)現(xiàn)光信號與激素信號互相關聯(lián)[4]。因此,外源激素可能直接或者間接調(diào)控茶樹CsCRY1和CsCRY2基因的轉(zhuǎn)錄和表達。
綜上所述,本研究克隆到茶樹CsCRY1和CsCRY2基因,CsCRY1和CsCRY2蛋白具有典型的Plant CRY類隱花色素結(jié)構(gòu)特征;可利用隱花色素高保守度、低拷貝的特點,開發(fā)用于構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育的分類標記;藍光介導了CsCRY1和CsCRY2基因的轉(zhuǎn)錄表達并可能在蛋白光信號傳導上發(fā)揮作用;外源激素介導了CsCRY1和CsCRY2基因的轉(zhuǎn)錄,激素信號可能與光信號互相關聯(lián)調(diào)節(jié)生物學過程。