吳沂旎，吳寧玲， 莊曾淵

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院(北京 100040)

川芎嗪被廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜、視神經(jīng)缺血性疾病的治療，藥理研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪是從川芎根莖中分離出的生物堿單體，又名四甲基吡嗪，可抵抗交感神經(jīng)的血管收縮、促進(jìn)血液循環(huán)、抑制血小板聚集反應(yīng)、阻抑血栓形成，調(diào)節(jié)各種血管活性物質(zhì)的釋放[1]。然而，對(duì)于缺血性眼底病的作用機(jī)理尚未明確，目前欠缺合理用藥的依據(jù)。近幾年大量研究證實(shí)，因各種原因?qū)е碌难鄣兹毖约膊∨c眼底視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞受損及其血管相關(guān)活性因子失調(diào)相關(guān)[2]。因而，研究保護(hù)眼底血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機(jī)理，預(yù)防其功能損傷是預(yù)防這類(lèi)疾病優(yōu)選方案。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)觀察川芎嗪對(duì)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(Retinal vascular endothelial cell，RVEC)血管舒縮因子的作用，進(jìn)而為不同的缺血性眼底病變提供實(shí)驗(yàn)及理論根據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)、胎牛血清(四季青公司)、生長(zhǎng)因子(中日友好醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室)、鹽酸川芎嗪注射液(規(guī)格：40 mg，鄭州卓峰制藥有限公司)、牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮原代細(xì)胞(購(gòu)于北京中日友好醫(yī)院細(xì)胞庫(kù))、谷氨酰胺、雙抗、肝素(上海西唐生物科技有限公司)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)、內(nèi)皮素-1(ET-1，Endothelin-1)、兔抗人多克隆抗體(Acris生物技術(shù)公司)。

1.2 儀器與設(shè)備：倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、ELX808 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)、伯樂(lè)電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-RAD公司)、勻漿器(型號(hào)：PRO200，美國(guó)PRO公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮原代細(xì)胞復(fù)蘇，從液氮中取出細(xì)胞凍存管，直接浸入37 ℃水浴鍋中，快速震搖使其預(yù)熱解凍，將解凍后的細(xì)胞懸濁液移入離心管中，轉(zhuǎn)速1000 r/min，常溫下離心5 min，棄去上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液[含200 g/L FBS、100 mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(Endothelial cellgrowth supplemen，tECGS)、100 mg/L肝素以及1 g/L雙抗]，靜置后移入明膠包被的培養(yǎng)瓶。置于5%的CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中。次日待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液。觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度便可傳代1次，選取第6代細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組：選取長(zhǎng)勢(shì)較好，貼壁達(dá)80%的細(xì)胞，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。待48 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或扁平形，細(xì)胞緊密連接，呈鵝卵石樣鑲嵌排列時(shí)，加入PBS溶解的 CoCl2100 μmol/L進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h；隨機(jī)分為三組。缺氧對(duì)照組:不含藥物、無(wú)生長(zhǎng)因子及血清的培養(yǎng)液組。川芎嗪0.02 μg/ml組：缺氧組+含終濃度為0.02 μg/ml川芎嗪的培養(yǎng)基。川芎嗪0.2 μg/ml組：缺氧組+含終濃度為0.2 μg/ml川芎嗪的培養(yǎng)基。

2.3 MTT法檢測(cè)各組的吸光度值：收取分組好的細(xì)胞懸濁液，將密度調(diào)至2×105個(gè)/ml，種于96孔板上,每孔200 μl,培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT，培育4 h后,棄去上清液及培養(yǎng)基,每孔加入二甲亞砜150 μl,在搖床上震蕩8 min打勻,待藍(lán)色結(jié)晶充分溶解,用自動(dòng)酶標(biāo)儀 (波長(zhǎng)562 nm) 測(cè)定各孔光吸光度A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量4次。

2.4 Western blot法檢測(cè)各組RVEC內(nèi)eNOS、 ET-1蛋白的表達(dá)：取分組收集的細(xì)胞分別移入1、2、3號(hào)離心管內(nèi)，并加入100 μl裂解液，將離心管放入冰盒內(nèi)孵育20 min，12000 r/min離心，20 min后提取上清液，分裝。將做好標(biāo)記的96孔板內(nèi)分別加入稀釋好的1～3號(hào) BCA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品各25 μl，每孔加入200 μl BCA工作液，充分混勻后至37 ℃孵育30 min，冷卻后用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處的吸光度值，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。在收集蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，放入沸水中加熱5 min，冷卻后，3000 r/min，30 s后離心備用。將SDS聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，放入封閉液內(nèi)封閉1 h。將膜放入一抗( NOS 1∶100，ET-1 1∶1500)內(nèi)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST液洗10 min，4遍，按(1∶10000)稀釋二抗，把膜放入二抗內(nèi)，孵育50 min。TBST液沖洗6次，ECL試劑顯色曝光，沖洗顯示條帶，電泳條帶密度值以灰度值表示，并以β-actin作為內(nèi)參照。信號(hào)強(qiáng)度用IMAGEJ圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)1 d后，呈梭形或扁平形，細(xì)胞透亮，活性良好，細(xì)胞緊密連接，呈鵝卵石樣鑲嵌排列；加入CoCl2100 μmol/L進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，缺氧在多方面造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，生長(zhǎng)受到抑制，可見(jiàn)細(xì)胞膜受損，細(xì)胞排列密度降低，部分細(xì)胞脫落甚至凋亡，造模成功；在缺氧受損的細(xì)胞中分別加入川芎嗪濃度為0.02、0.2 μg/ml的藥液，細(xì)胞密度逐漸增高,凋亡細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞排列較缺氧組密集(圖1)。

2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況 缺氧對(duì)照組及川芎嗪各組的吸光度值均較正常細(xì)胞組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。川芎嗪0.02 μg/ml組、0.2 μg/ml組細(xì)胞的吸光度值明顯高于缺氧對(duì)照組 (P<0.01)，且川芎嗪0.2 μg/ml組的吸光度值高于川芎嗪0.02 μg/ml組(P<0.01)，即與濃度呈正相關(guān)性。見(jiàn)表1。

A：正常細(xì)胞組；B：缺氧對(duì)照組；C：川芎嗪0.02 μg/ml組；D：川芎嗪0.2 μg/ml組

表1 MTT法檢測(cè)各組在缺氧狀態(tài)下RVEC增殖情況比較

3 各組eNOS、ET-1蛋白表達(dá)結(jié)果 采用LSD方法進(jìn)行比較。與缺氧對(duì)照組相比，川芎嗪0.02 μg/ml組及0.2 μg/ml組的eNOS蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且川芎嗪濃度與蛋白表達(dá)呈正相關(guān)；兩組川芎嗪組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與缺氧對(duì)照組相比，川芎嗪0.02 μg/ml組及川芎嗪0.2 μg/ml組的ET-1蛋白表達(dá)均下降，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但兩組川芎嗪組間ET-1蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2(圖2)。

表2 各組eNOS、ET-1蛋白表達(dá)及平均灰度值比較

1：缺氧對(duì)照組；2：川芎嗪0.02 μg/ml 組；3：川芎嗪0.2 μg/ml 組

討 論

川芎味辛、溫，入肝膽、心包經(jīng)。川芎嗪是川芎根莖中分離的有效成分，屬吡嗪類(lèi)生物堿。川芎嗪具有抗凝、抗血栓形成、擴(kuò)張血管、降低血黏度、改善微循環(huán)等作用。眼科領(lǐng)域中川芎嗪對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，主要通過(guò)減少細(xì)胞凋亡、抗氧化自由基作用、改善血液流變作用、Ca2+離子通道阻滯劑的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。因此，川芎嗪被廣泛應(yīng)用于閉塞性血管疾病、缺血性心腦血管疾病。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪能阻抑非酶糖化終末產(chǎn)物的形成，降低視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子過(guò)度表達(dá)，從而防止新生血管不斷生成，改善眼底血管組織缺血缺氧狀態(tài)[4]。目前已經(jīng)有川芎嗪對(duì)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究[5]，但對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究甚少。鄧新國(guó)等[6]通過(guò)腹腔靜脈注射鹽酸川芎嗪實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析兔眼視網(wǎng)膜組織的藥代動(dòng)力學(xué)，該實(shí)驗(yàn)證明川芎嗪能夠滲入血視網(wǎng)膜屏障進(jìn)入眼底視網(wǎng)膜，該結(jié)論為川芎嗪能全身用藥治療視網(wǎng)膜血管病變及眼底缺血性疾病提供了理論依據(jù)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血液與血管平滑肌細(xì)胞之間的機(jī)械屏障，是人體最重要的內(nèi)分泌器官[7]，容易受到體內(nèi)外各種致病因素?fù)p傷，損傷后其分泌活性物質(zhì)之間的平衡被打破，從而引起血管功能系統(tǒng)障礙[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞主要分泌兩種活性物質(zhì)：舒血管物質(zhì)，如NO、前列環(huán)素、內(nèi)皮源性舒張因子等；縮血管物質(zhì)，如內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮細(xì)胞收縮因子等。其中NO和ET-1是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損程度最可靠、最直接的標(biāo)志[9]。生理情況下ET-1具有內(nèi)皮細(xì)胞最強(qiáng)的收縮作用，可使血管收縮、管腔狹窄、血流緩慢、外周阻力增加；而NO可抑制血管內(nèi)皮素的分泌，舒張血管，增加局部血流，抑制血小板的活化和凝集[10]。二者作為平衡使者，維持著血流量的相對(duì)穩(wěn)定和血管床的靜息舒縮狀態(tài)。缺氧環(huán)境下可引起視網(wǎng)膜血管多方面病理變化，如新生血管形成、血管滲透性增加、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷最終引起視覺(jué)功能喪失等。缺氧在多方面造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[11]。此時(shí)一氧化氮含量減少、ET-1釋放增多，二者平衡失調(diào)，致使血管舒縮功能紊亂，促使眼底視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。

NO作為內(nèi)皮源性舒張因子,具有擴(kuò)張血管和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，由限速酶NOS催化L-精氨酸脫胍基生成。NOS有三種亞型，其中eNOS分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，它產(chǎn)生的NO更接近血管平滑肌，可以激活血管平滑肌中的可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cAMP濃度升高，從而起到擴(kuò)張血管、抑制血小板凝集作用[12]。eNOS活力水平直接影響NO的合成。NO為小分子氣體物質(zhì)不易檢測(cè)，我們通過(guò)檢測(cè)NO合成的eNOS，間接檢測(cè)NO的表達(dá)[13]。本研究中川芎嗪各藥物組血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)均升高，與缺氧對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且隨著藥物濃度增加蛋白含量增加；說(shuō)明川芎嗪通過(guò)增強(qiáng)eNOS的活性來(lái)促進(jìn)NO的分泌合成，從而擴(kuò)張血管、抑制血小板凝集。在本實(shí)驗(yàn)中，川芎嗪能顯著上調(diào) eNOS的表達(dá)，可以推斷川芎嗪逆轉(zhuǎn)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其部分機(jī)制是通過(guò)上調(diào)eNOS的表達(dá)，從而增加內(nèi)皮血管產(chǎn)生NO介導(dǎo)的。

ET是一種內(nèi)源性長(zhǎng)效血管收縮因子，用來(lái)調(diào)節(jié)血管緊張性及局部血液循環(huán)的縮血管活性肽。ET具有4種異構(gòu)體。其中縮血管作用最強(qiáng)的是ET-1[14]。在心臟和血管上有豐富的ET-1受體，ET-1與組織中相應(yīng)受體結(jié)合，激活第二信息cGMP，繼發(fā)三磷酸肌醇水平增高，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高，使Ca2+內(nèi)流，血管收縮。最終導(dǎo)致組織缺血、缺氧，自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是缺血性視網(wǎng)膜病變的一個(gè)突出特點(diǎn)。近年來(lái)研究報(bào)道糖尿病患者血漿中ET-1呈現(xiàn)高濃度狀態(tài)，正常眼壓性青光眼患者血漿ET-1水平較健康對(duì)照組明顯升高。視神經(jīng)炎、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、球后視神經(jīng)炎等缺血性眼病患者血漿ET-1水平升高[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：川芎嗪能顯著降低ET-1蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈濃度負(fù)相關(guān)性，與前期臨床實(shí)驗(yàn)一致；說(shuō)明川芎嗪可抑制缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-1，減輕血管收縮，從而改善眼部缺血病理狀態(tài)，減輕細(xì)胞損傷。

我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以改善缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，對(duì)細(xì)胞的增殖有一定促增長(zhǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明川芎嗪組能促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌eNOS、減少ET-1生成，并呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。說(shuō)明川芎嗪能通過(guò)上調(diào)NO抑制血管內(nèi)皮素的分泌，舒張血管增加局部血流；同時(shí)抑制ET-1的分泌減輕血管收縮，減少外周阻力；從而維持血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮血管物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。可以推測(cè)因缺血缺氧導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷從而引起嚴(yán)重的眼底病變，川芎嗪可在一定程度上阻斷內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致的部分病理變化，從而減輕小血管痙攣，增加視網(wǎng)膜血液供應(yīng)，改善患者視功能，可望為治療這類(lèi)眼部疾病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。