亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        川芎嗪對(duì)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管舒縮因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

        2020-12-16 07:55:56吳沂旎吳寧玲莊曾淵
        陜西中醫(yī) 2020年12期
        關(guān)鍵詞:川芎嗪內(nèi)皮細(xì)胞視網(wǎng)膜

        吳沂旎,吳寧玲, 莊曾淵

        1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003);2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院(北京 100040)

        川芎嗪被廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜、視神經(jīng)缺血性疾病的治療,藥理研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪是從川芎根莖中分離出的生物堿單體,又名四甲基吡嗪,可抵抗交感神經(jīng)的血管收縮、促進(jìn)血液循環(huán)、抑制血小板聚集反應(yīng)、阻抑血栓形成,調(diào)節(jié)各種血管活性物質(zhì)的釋放[1]。然而,對(duì)于缺血性眼底病的作用機(jī)理尚未明確,目前欠缺合理用藥的依據(jù)。近幾年大量研究證實(shí),因各種原因?qū)е碌难鄣兹毖约膊∨c眼底視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞受損及其血管相關(guān)活性因子失調(diào)相關(guān)[2]。因而,研究保護(hù)眼底血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機(jī)理,預(yù)防其功能損傷是預(yù)防這類(lèi)疾病優(yōu)選方案。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)觀(guān)察川芎嗪對(duì)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(Retinal vascular endothelial cell,RVEC)血管舒縮因子的作用,進(jìn)而為不同的缺血性眼底病變提供實(shí)驗(yàn)及理論根據(jù)。

        材料與方法

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)、胎牛血清(四季青公司)、生長(zhǎng)因子(中日友好醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室)、鹽酸川芎嗪注射液(規(guī)格:40 mg,鄭州卓峰制藥有限公司)、牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮原代細(xì)胞(購(gòu)于北京中日友好醫(yī)院細(xì)胞庫(kù))、谷氨酰胺、雙抗、肝素(上海西唐生物科技有限公司)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)、內(nèi)皮素-1(ET-1,Endothelin-1)、兔抗人多克隆抗體(Acris生物技術(shù)公司)。

        1.2 儀器與設(shè)備:倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、ELX808 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)、伯樂(lè)電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-RAD公司)、勻漿器(型號(hào):PRO200,美國(guó)PRO公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮原代細(xì)胞復(fù)蘇,從液氮中取出細(xì)胞凍存管,直接浸入37 ℃水浴鍋中,快速震搖使其預(yù)熱解凍,將解凍后的細(xì)胞懸濁液移入離心管中,轉(zhuǎn)速1000 r/min,常溫下離心5 min,棄去上清液,加入DMEM完全培養(yǎng)液[含200 g/L FBS、100 mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(Endothelial cellgrowth supplemen,tECGS)、100 mg/L肝素以及1 g/L雙抗],靜置后移入明膠包被的培養(yǎng)瓶。置于5%的CO2,37 ℃的培養(yǎng)箱中。次日待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液。觀(guān)察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度便可傳代1次,選取第6代細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

        2.2 實(shí)驗(yàn)分組:選取長(zhǎng)勢(shì)較好,貼壁達(dá)80%的細(xì)胞,按1∶3比例傳代培養(yǎng)。待48 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈梭形或扁平形,細(xì)胞緊密連接,呈鵝卵石樣鑲嵌排列時(shí),加入PBS溶解的 CoCl2100 μmol/L進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h;隨機(jī)分為三組。缺氧對(duì)照組:不含藥物、無(wú)生長(zhǎng)因子及血清的培養(yǎng)液組。川芎嗪0.02 μg/ml組:缺氧組+含終濃度為0.02 μg/ml川芎嗪的培養(yǎng)基。川芎嗪0.2 μg/ml組:缺氧組+含終濃度為0.2 μg/ml川芎嗪的培養(yǎng)基。

        2.3 MTT法檢測(cè)各組的吸光度值:收取分組好的細(xì)胞懸濁液,將密度調(diào)至2×105個(gè)/ml,種于96孔板上,每孔200 μl,培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μl MTT,培育4 h后,棄去上清液及培養(yǎng)基,每孔加入二甲亞砜150 μl,在搖床上震蕩8 min打勻,待藍(lán)色結(jié)晶充分溶解,用自動(dòng)酶標(biāo)儀 (波長(zhǎng)562 nm) 測(cè)定各孔光吸光度A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量4次。

        2.4 Western blot法檢測(cè)各組RVEC內(nèi)eNOS、 ET-1蛋白的表達(dá):取分組收集的細(xì)胞分別移入1、2、3號(hào)離心管內(nèi),并加入100 μl裂解液,將離心管放入冰盒內(nèi)孵育20 min,12000 r/min離心,20 min后提取上清液,分裝。將做好標(biāo)記的96孔板內(nèi)分別加入稀釋好的1~3號(hào) BCA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品各25 μl,每孔加入200 μl BCA工作液,充分混勻后至37 ℃孵育30 min,冷卻后用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處的吸光度值,計(jì)算樣品中的蛋白濃度。在收集蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE上樣緩沖液混勻,放入沸水中加熱5 min,冷卻后,3000 r/min,30 s后離心備用。將SDS聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,放入封閉液內(nèi)封閉1 h。將膜放入一抗( NOS 1∶100,ET-1 1∶1500)內(nèi),4 ℃孵育過(guò)夜。TBST液洗10 min,4遍,按(1∶10000)稀釋二抗,把膜放入二抗內(nèi),孵育50 min。TBST液沖洗6次,ECL試劑顯色曝光,沖洗顯示條帶,電泳條帶密度值以灰度值表示,并以β-actin作為內(nèi)參照。信號(hào)強(qiáng)度用IMAGEJ圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

        結(jié) 果

        1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)1 d后,呈梭形或扁平形,細(xì)胞透亮,活性良好,細(xì)胞緊密連接,呈鵝卵石樣鑲嵌排列;加入CoCl2100 μmol/L進(jìn)行缺氧誘導(dǎo),細(xì)胞數(shù)量明顯減少,缺氧在多方面造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,生長(zhǎng)受到抑制,可見(jiàn)細(xì)胞膜受損,細(xì)胞排列密度降低,部分細(xì)胞脫落甚至凋亡,造模成功;在缺氧受損的細(xì)胞中分別加入川芎嗪濃度為0.02、0.2 μg/ml的藥液,細(xì)胞密度逐漸增高,凋亡細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞排列較缺氧組密集(圖1)。

        2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況 缺氧對(duì)照組及川芎嗪各組的吸光度值均較正常細(xì)胞組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。川芎嗪0.02 μg/ml組、0.2 μg/ml組細(xì)胞的吸光度值明顯高于缺氧對(duì)照組 (P<0.01),且川芎嗪0.2 μg/ml組的吸光度值高于川芎嗪0.02 μg/ml組(P<0.01),即與濃度呈正相關(guān)性。見(jiàn)表1。

        A:正常細(xì)胞組;B:缺氧對(duì)照組;C:川芎嗪0.02 μg/ml組;D:川芎嗪0.2 μg/ml組

        表1 MTT法檢測(cè)各組在缺氧狀態(tài)下RVEC增殖情況比較

        3 各組eNOS、ET-1蛋白表達(dá)結(jié)果 采用LSD方法進(jìn)行比較。與缺氧對(duì)照組相比,川芎嗪0.02 μg/ml組及0.2 μg/ml組的eNOS蛋白表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且川芎嗪濃度與蛋白表達(dá)呈正相關(guān);兩組川芎嗪組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與缺氧對(duì)照組相比,川芎嗪0.02 μg/ml組及川芎嗪0.2 μg/ml組的ET-1蛋白表達(dá)均下降,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但兩組川芎嗪組間ET-1蛋白表達(dá)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2(圖2)。

        表2 各組eNOS、ET-1蛋白表達(dá)及平均灰度值比較

        1:缺氧對(duì)照組;2:川芎嗪0.02 μg/ml 組;3:川芎嗪0.2 μg/ml 組

        討 論

        川芎味辛、溫,入肝膽、心包經(jīng)。川芎嗪是川芎根莖中分離的有效成分,屬吡嗪類(lèi)生物堿。川芎嗪具有抗凝、抗血栓形成、擴(kuò)張血管、降低血黏度、改善微循環(huán)等作用。眼科領(lǐng)域中川芎嗪對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,主要通過(guò)減少細(xì)胞凋亡、抗氧化自由基作用、改善血液流變作用、Ca2+離子通道阻滯劑的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。因此,川芎嗪被廣泛應(yīng)用于閉塞性血管疾病、缺血性心腦血管疾病。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪能阻抑非酶糖化終末產(chǎn)物的形成,降低視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子過(guò)度表達(dá),從而防止新生血管不斷生成,改善眼底血管組織缺血缺氧狀態(tài)[4]。目前已經(jīng)有川芎嗪對(duì)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究[5],但對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究甚少。鄧新國(guó)等[6]通過(guò)腹腔靜脈注射鹽酸川芎嗪實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析兔眼視網(wǎng)膜組織的藥代動(dòng)力學(xué),該實(shí)驗(yàn)證明川芎嗪能夠滲入血視網(wǎng)膜屏障進(jìn)入眼底視網(wǎng)膜,該結(jié)論為川芎嗪能全身用藥治療視網(wǎng)膜血管病變及眼底缺血性疾病提供了理論依據(jù)。

        血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血液與血管平滑肌細(xì)胞之間的機(jī)械屏障,是人體最重要的內(nèi)分泌器官[7],容易受到體內(nèi)外各種致病因素?fù)p傷,損傷后其分泌活性物質(zhì)之間的平衡被打破,從而引起血管功能系統(tǒng)障礙[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞主要分泌兩種活性物質(zhì):舒血管物質(zhì),如NO、前列環(huán)素、內(nèi)皮源性舒張因子等;縮血管物質(zhì),如內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮細(xì)胞收縮因子等。其中NO和ET-1是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損程度最可靠、最直接的標(biāo)志[9]。生理情況下ET-1具有內(nèi)皮細(xì)胞最強(qiáng)的收縮作用,可使血管收縮、管腔狹窄、血流緩慢、外周阻力增加;而NO可抑制血管內(nèi)皮素的分泌,舒張血管,增加局部血流,抑制血小板的活化和凝集[10]。二者作為平衡使者,維持著血流量的相對(duì)穩(wěn)定和血管床的靜息舒縮狀態(tài)。缺氧環(huán)境下可引起視網(wǎng)膜血管多方面病理變化,如新生血管形成、血管滲透性增加、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷最終引起視覺(jué)功能喪失等。缺氧在多方面造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[11]。此時(shí)一氧化氮含量減少、ET-1釋放增多,二者平衡失調(diào),致使血管舒縮功能紊亂,促使眼底視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。

        NO作為內(nèi)皮源性舒張因子,具有擴(kuò)張血管和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用,由限速酶NOS催化L-精氨酸脫胍基生成。NOS有三種亞型,其中eNOS分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞,它產(chǎn)生的NO更接近血管平滑肌,可以激活血管平滑肌中的可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶,使胞內(nèi)cAMP濃度升高,從而起到擴(kuò)張血管、抑制血小板凝集作用[12]。eNOS活力水平直接影響NO的合成。NO為小分子氣體物質(zhì)不易檢測(cè),我們通過(guò)檢測(cè)NO合成的eNOS,間接檢測(cè)NO的表達(dá)[13]。本研究中川芎嗪各藥物組血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)均升高,與缺氧對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且隨著藥物濃度增加蛋白含量增加;說(shuō)明川芎嗪通過(guò)增強(qiáng)eNOS的活性來(lái)促進(jìn)NO的分泌合成,從而擴(kuò)張血管、抑制血小板凝集。在本實(shí)驗(yàn)中,川芎嗪能顯著上調(diào) eNOS的表達(dá),可以推斷川芎嗪逆轉(zhuǎn)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,其部分機(jī)制是通過(guò)上調(diào)eNOS的表達(dá),從而增加內(nèi)皮血管產(chǎn)生NO介導(dǎo)的。

        ET是一種內(nèi)源性長(zhǎng)效血管收縮因子,用來(lái)調(diào)節(jié)血管緊張性及局部血液循環(huán)的縮血管活性肽。ET具有4種異構(gòu)體。其中縮血管作用最強(qiáng)的是ET-1[14]。在心臟和血管上有豐富的ET-1受體,ET-1與組織中相應(yīng)受體結(jié)合,激活第二信息cGMP,繼發(fā)三磷酸肌醇水平增高,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高,使Ca2+內(nèi)流,血管收縮。最終導(dǎo)致組織缺血、缺氧,自由基產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是缺血性視網(wǎng)膜病變的一個(gè)突出特點(diǎn)。近年來(lái)研究報(bào)道糖尿病患者血漿中ET-1呈現(xiàn)高濃度狀態(tài),正常眼壓性青光眼患者血漿ET-1水平較健康對(duì)照組明顯升高。視神經(jīng)炎、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、球后視神經(jīng)炎等缺血性眼病患者血漿ET-1水平升高[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:川芎嗪能顯著降低ET-1蛋白的表達(dá),與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且呈濃度負(fù)相關(guān)性,與前期臨床實(shí)驗(yàn)一致;說(shuō)明川芎嗪可抑制缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-1,減輕血管收縮,從而改善眼部缺血病理狀態(tài),減輕細(xì)胞損傷。

        我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以改善缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性,對(duì)細(xì)胞的增殖有一定促增長(zhǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明川芎嗪組能促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌eNOS、減少ET-1生成,并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系。說(shuō)明川芎嗪能通過(guò)上調(diào)NO抑制血管內(nèi)皮素的分泌,舒張血管增加局部血流;同時(shí)抑制ET-1的分泌減輕血管收縮,減少外周阻力;從而維持血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮血管物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡??梢酝茰y(cè)因缺血缺氧導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷從而引起嚴(yán)重的眼底病變,川芎嗪可在一定程度上阻斷內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致的部分病理變化,從而減輕小血管痙攣,增加視網(wǎng)膜血液供應(yīng),改善患者視功能,可望為治療這類(lèi)眼部疾病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        猜你喜歡
        川芎嗪內(nèi)皮細(xì)胞視網(wǎng)膜
        深度學(xué)習(xí)在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)\療中的應(yīng)用
        家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變合并孔源性視網(wǎng)膜脫離1例
        高度近視視網(wǎng)膜微循環(huán)改變研究進(jìn)展
        淺議角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查
        川芎嗪治療膿毒癥的機(jī)制研究進(jìn)展綜述
        雌激素治療保護(hù)去卵巢對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初步機(jī)制
        復(fù)明片治療糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜光凝術(shù)后臨床觀(guān)察
        丹參川芎嗪注射液治療腦血栓的可行性探究
        細(xì)胞微泡miRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控
        痰瘀與血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系研究
        亚洲综合久久久中文字幕| 亚洲av综合久久九九| 欧美日本日韩aⅴ在线视频| 亚洲日韩成人无码不卡网站 | 激情五月天在线观看视频| 国产乱人偷精品人妻a片| 中文字幕人妻丝袜美腿乱| 无码高清视频在线播放十区| 中文字幕人妻互换激情| 一本丁香综合久久久久不卡网站| 久久久久久国产精品美女| 色婷婷色99国产综合精品| 永久中文字幕av在线免费| 精品国产这么小也不放过| 国产真人无遮挡作爱免费视频| 亚洲成a人片在线观看中| 中文字幕av永久免费在线| 午夜精品久久久久久毛片| 久久99欧美| 成人短篇在线视频夫妻刺激自拍| 亚洲精品1区2区在线观看| 亚洲精品无码久久久久牙蜜区 | 中文字幕午夜精品久久久| 偷偷色噜狠狠狠狠的777米奇| 亚洲视频天堂| 视频在线播放观看免费| 国产自国产自愉自愉免费24区| 免费无码毛片一区二区三区a片| 国产精品亚洲ΑV天堂无码| 谷原希美中文字幕在线| 欧美人妻少妇精品久久黑人| 国产一级毛片AV不卡尤物| 国产av精品一区二区三区不卡 | 日本一区二区三区在线观看视频| 亚洲爆乳无码精品aaa片蜜桃| a亚洲va欧美va国产综合| 亚洲黄片久久| 少妇人妻中文久久综合| 国产成人av性色在线影院色戒 | 人妻av不卡一区二区三区| 亚洲av无码偷拍在线观看|