楊美玲，崔東亞，牛潤華

（運(yùn)城學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000）

三聚氰胺［Melamine，C3N3（NH2）3］又名蛋白精，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。在溶液中呈弱堿性，與三大強(qiáng)酸均能形成三聚氰胺鹽，是一種常用的化工產(chǎn)品［1-3］。三聚氰胺具有低毒性，長期服用會導(dǎo)致腎結(jié)石和膀胱結(jié)石，尤其對免疫力較低的嬰幼兒，傷害更大［4，5］。在美國，三聚氰胺作為飼料非法添加劑已被明令禁止使用，主要原因是在2007年曾誘發(fā)了當(dāng)?shù)卮罅康膶櫸锼劳?。目前，對三聚氰胺與血清白蛋白相互作用探討的文獻(xiàn)很少，本試驗主要研究了在接近生理條件的基礎(chǔ)上，以三聚氰胺和體內(nèi)血液中蛋白含量較高的血清白蛋白作為作用原型，利用熒光光譜和紫外-可見吸收光譜作為研究工具，研究三聚氰胺與BSA相互作用的熒光猝滅效果和熱力學(xué)特征，求算其相互作用的相關(guān)作用常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，分析兩者相互作用的機(jī)制，為三聚氰胺中毒的臨床病癥以及藥代動力學(xué)的深入研究提供有價值的信息。

圖1 三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計（美國Agilent公司，Agilent-8453型）；熒光分光光度計（美國PE公司，LS-55型）；圓二色譜儀（日本Jasco公司，J-810型）；恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

三聚氰胺三（羥甲基）胺基甲烷（Tris）、濃鹽酸等均為分析純；牛血清白蛋白（BSA）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BSA和三聚氰胺溶液均以pH 7.40、濃度0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含維持離子強(qiáng)度50 mmol/L NaCl溶液）為溶劑配制而成，儲備液放入冰箱中待用。試驗用水為二次去離子蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜法 在室溫下，以Tris-HCl（pH=7.40）緩沖溶液為參比，在300～450 nm內(nèi)掃描2.00×10-3mol/L三聚氰胺的紫外吸收光譜。

1.2.2 熒光光譜法 在不同溫度下，以280 nm為激發(fā)波長，掃描三聚氰胺溶液（2.00×10-3mol/L）滴定10.0 mL 3.0×10-6mol/L牛血清白蛋白溶液得熒光發(fā)射光譜。

1.2.3 圓二色譜法 以Tris-HCl（pH 7.40）緩沖溶液為參比，在室溫下，用濃度為2.00×10-3mol/L的三聚氰胺溶液滴定10 mL 3.00×10-6mol/L的BSA溶液，掃描其190～250 nm的圓二色譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見光譜分析

圖2為三聚氰胺與BSA相互作用的紫外-可見吸收光譜。由圖2可知，BSA最大吸收峰在280 nm處，隨著三聚氰胺濃度不斷增大，BSA吸收強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，而三聚氰胺在這一范圍內(nèi)沒有紫外吸收，說明BSA紫外吸收強(qiáng)度的變化是由于三聚氰胺的加入而引起的，故此可初步判定三聚氰胺和BSA發(fā)生了相互作用，形成了一種新的復(fù)合物。

圖2 三聚氰胺與BSA紫外吸收光譜

2.2 熒光光譜

圖3 是不同溫度下三聚氰胺與BSA相互作用的熒光光譜，圖3中曲線1～9（按照最高熒光強(qiáng)度的峰值由高到低排列）分別代表nBSA∶nMelamine=1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶6，1∶9，1∶12，1∶15，1∶18體系。由圖3可知，BSA的熒光強(qiáng)度隨著三聚氰胺濃度的增大而逐漸減小，而三聚氰胺在300～500 nm基本沒有熒光，進(jìn)一步說明三聚氰胺與BSA之間可發(fā)生相互作用形成了新的復(fù)合物致使BSA的熒光發(fā)生猝滅。

圖3 三聚氰胺與BSA的熒光光譜

2.3 熒光猝滅機(jī)理

2.3.1 猝滅常數(shù) 熒光分子和小分子藥物之間相互作用致使熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度有所減弱的物理或化學(xué)過程稱為熒光猝滅或熒光熄滅。熒光猝滅一般可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種。熒光分子和小分子藥物之間由于發(fā)生碰撞引起熒光強(qiáng)度減弱的是動態(tài)猝滅，在這一過程中體系溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，因此在動態(tài)猝滅過程中猝滅常數(shù)也會伴隨著溫度的升高而逐漸增大，但卻不會影響到熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。而靜態(tài)猝滅則是熒光分子在基態(tài)時就與小分子藥物相互作用，從而形成不發(fā)熒光的或是熒光很弱的一種新型復(fù)合物，從而使得熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)生猝滅。但是由于復(fù)合物的穩(wěn)定性會隨著溫度的升高而減弱，因此在靜態(tài)猝滅過程中，猝滅常數(shù)會隨著溫度的升高而減小。

通常動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程［6，7］：

式中，Q為三聚氰胺濃度（mol/L）；Kq為三聚氰胺對BSA猝滅過程中的雙分子猝滅速率常數(shù)（L/mol·s）；τ0為猝滅劑不存在時熒光 體生物大分子的壽命，為10-8s［8］；F0為沒有加入三聚氰胺時BSA的熒光強(qiáng)度；F為加入三聚氰胺后BSA的熒光強(qiáng)度。以Q作為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F作縱坐標(biāo)繪制Stern-Volmer曲線，所得曲線斜率即為KSV，如圖4所示，若將體系視為動態(tài)猝滅，則可通過K SV求得雙分子猝滅速率常數(shù)K q，具體計算數(shù)據(jù)見表1。

表1 不同溫度下三聚氰胺與BSA相互作用的猝滅常數(shù)

一般動態(tài)猝滅常數(shù)會隨著溫度的升高而不斷增大，但從圖4和表1可以看出，在不同溫度下，三聚氰胺對BSA的熒光動態(tài)猝滅常數(shù)K S V隨著溫度的升高變化不大，而雙分子猝滅速率常數(shù)Kq卻比小分子藥物猝滅劑對蛋白質(zhì)的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)2.0×1010L/mol·s大的多。由此可推斷出三聚氰胺對BSA的熒光猝滅不是由于分子碰撞所引起的動態(tài)猝滅，而應(yīng)是由三聚氰胺和BSA二者之間相互作用形成了新的復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅。

圖4 三聚氰胺與BSA相互作用的Stern-Volme曲線

2.3.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 在靜態(tài)猝滅過程中，三聚氰胺分子會在蛋白質(zhì)分子上n1個相同且獨(dú)立位置上與其結(jié)合，且其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及其對熒光猝滅劑的用量均符合Lineweaver-Burk方程［9］。

式中，KA和n1分別表示兩者的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg(F0/F-1)對lgQ作圖，可得圖5，依據(jù)斜率和截距可以求算出三聚氰胺與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n1，具體計算數(shù)據(jù)見表2。由表2可知，三聚氰胺與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n1約為1，即1個三聚氰胺藥物分子會與1個BSA上的某個位點(diǎn)處結(jié)合；而結(jié)合常數(shù)KA均大于103，說明三聚氰胺與BSA之間的作用力較強(qiáng)。

表2 不同溫度下三聚氰胺與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

圖5 三聚氰胺與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線

2.3.3 作用力類型的確定 Ross等［10］總結(jié)了蛋白質(zhì)與小分子性質(zhì)結(jié)合存在的熱力學(xué)規(guī)律如下：若ΔH＞0、ΔS＞0，為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＞0，為靜電作用力；ΔH＜0、ΔS＜0，可以是氫鍵結(jié)合或通過范德華力結(jié)合。當(dāng)溫度上升幅度較小時，反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)焓ΔH可以看作常數(shù)，根據(jù)Gibbs—Helmholtz熱力學(xué)方程［11，12］式（3）至式（5）分別求得ΔH、ΔS、ΔG，其計算結(jié)果見表3。三聚氰胺與BSA結(jié)合的焓變ΔH＞0、熵變ΔS＞0，所以兩者之間主要依靠疏水作用力相結(jié)合。

表3 三聚氰胺與BSA在不同溫度下相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.3.4 結(jié)合距離的計算 按照F?rster能量轉(zhuǎn)移原理，若熒光體的熒光發(fā)射光譜和猝滅劑的紫外吸收光譜有重疊部分，且兩者之間的結(jié)合距離不超過7 nm，則熒光體發(fā)生熒光猝滅的主要原因之一是非輻射能量的轉(zhuǎn)移。

圖6是三聚氰胺與BSA的熒光光譜和紫外吸收光譜的重疊情況。猝滅劑三聚氰胺和BSA的結(jié)合距離r0和它們之間的能量轉(zhuǎn)移效率E及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間的關(guān)系遵循式（6）［12，13］。

圖6 BSA的熒光光譜和三聚氰胺的紫外光譜的重疊

式中，F(xiàn)為BSA和三聚氰胺濃度為1∶1時溶液的熒光強(qiáng)度。

R0與三聚氰胺的熒光量子產(chǎn)率φ、偶極空間取向因子k2以及介質(zhì)折射指數(shù)存在式（7）關(guān)系。

式中，k2=2/3，φ=0.118，N=1.336，J為BSA熒光光譜與三聚氰胺吸收光譜的重疊積分。

2.4 圓二色譜法

圓二色譜法是一種簡單、快速、靈敏的研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的光譜技術(shù)。圖7給出了不同濃度的三聚氰胺對牛血清白蛋白影響的CD光譜。圖7中1曲線為BSA空白，分別在208 nm和222 nm處出現(xiàn)了2個負(fù)峰，而隨著三聚氰胺濃度的不斷增大，BSA的CD光譜的振幅相應(yīng)明顯減弱，說明三聚氰胺與BSA結(jié)合后使得BSA的內(nèi)源熒光減弱，BSA的肽鏈伸展，α-螺旋減少，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化［14］。

圖7 三聚氰胺與BSA相互作用的CD光譜

3 結(jié)論

三聚氰胺對牛血清白蛋白的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，二者之間的相互作用力主要為疏水作用力，結(jié)合距離為3.7 nm，小于7.0 nm，因此三聚氰胺能使牛血清白蛋白的熒光發(fā)生猝滅的主要原因為非輻射能量轉(zhuǎn)移。圓二色譜測試結(jié)果表明，三聚氰胺能較大程度地改變牛血清白蛋白的二級結(jié)構(gòu)，因此對牛血清白蛋白具有較強(qiáng)的毒副作用。