李婧　俞寅　王麗娟　張?jiān)迄i　郝全英

[摘要]本文介紹了谷物和油料中甲拌磷、倍硫磷、樂果、辛硫磷、三唑磷、乙硫磷、馬拉硫磷、甲基嘧啶磷、敵敵畏、毒死蜱共10種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定方法。樣品經(jīng)乙腈提取、石墨化碳/氨基固相萃取柱凈化;質(zhì)譜采用電噴霧正離子源和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。結(jié)果顯示，10種農(nóng)藥在0.1～4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.99），方法定量限最低為0.15μg/kg，在20μg/kg、100μg/kg、400μg/kg加標(biāo)水平下回收率范圍為60.6%～113.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～14.76%。該方法靈敏度較高、準(zhǔn)確度良好，適用于谷物和油料中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的常規(guī)檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞]超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;谷物;油料;農(nóng)藥殘留

中圖分類號(hào)：TS207.53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202006

有機(jī)磷農(nóng)藥主要用于農(nóng)作物的病蟲害防治，因其高效、快速、廣譜等特點(diǎn)，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。然而由于有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥殘留帶來的安全問題也越發(fā)引起人們的重視。農(nóng)藥中毒可引發(fā)頭痛、惡心、腹痛等癥狀，嚴(yán)重者或可誘發(fā)癌癥，危及生命 [2-3]。因此，世界各國(guó)和地區(qū)均對(duì)食品中農(nóng)藥最大殘留限量做出了嚴(yán)格的限制[4-5]。

常見的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法有氣相色譜法（GC）[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[9]等。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有選擇性好、靈敏度高、結(jié)果精確、分析速度快等特點(diǎn)[10-11]，在農(nóng)藥殘留常規(guī)檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

谷物和油料具有低含水量、高淀粉、高蛋白、高脂肪等特點(diǎn)。運(yùn)用精密儀器分析時(shí)，樣品前處理過程至關(guān)重要，工藝優(yōu)化關(guān)鍵在于提高目標(biāo)化合物的提取效率和基質(zhì)凈化程度[12]。谷物和油料中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法主要有固相萃取法[13]、凝膠凈化色譜法[14]、QuEChERS法[15]等。本研究采用固相萃取技術(shù)，對(duì)玉米、小麥、稻谷、大豆、綠豆、高粱6種代表性較強(qiáng)的谷物和油料基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，獲得了兼顧回收率和凈化程度的良好效果。操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)節(jié)約，適用于谷物和油料中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的常規(guī)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米、小麥、稻谷、大豆、綠豆、高粱均為市售。

甲拌磷、倍硫磷、樂果、辛硫磷、三唑磷、乙硫磷、馬拉硫磷、甲基嘧啶磷、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液（均為100μg/mL）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

乙腈（農(nóng)殘級(jí)）、甲醇（色譜純）：迪馬科技;甲酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲苯（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水硫酸鈉（分析純，用前在650℃灼燒4h，貯于干燥器中，冷卻后備用）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;超純水。

Cleanert S C18固相萃取柱、Cleanert Florisil固相萃取柱、Cleanert PestiCarb/NH2固相萃取柱：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ QUANTUM Access MAX超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;LM3303保水式盤式粉碎磨：瑞典波通儀器公司;RE-52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠;YC-96數(shù)顯調(diào)速搖床：常州天意儀器廠;ScoutSE電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司;Dura 12F超純水機(jī)：澤拉布儀器科技（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL）500μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，充分混勻，得濃度為5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。于4℃冰箱保存，有效期3個(gè)月。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取空白樣品按1.3.1方法處理，得到基質(zhì)空白溶液，用其將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品提取與凈化

原料樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，全部過425μm的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，混勻備用。

準(zhǔn)確稱取10g樣品（精確至0.01g），放入150mL具塞三角瓶中，加入20mL乙腈，于振蕩器上200r/min振蕩30min。將提取液過濾至150mL梨形瓶中，殘?jiān)儆?0mL乙腈振蕩提取一次，合并提取液，待凈化。

將上述提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40℃水浴蒸發(fā)濃縮至約1mL，加入6mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）復(fù)溶。在Cleanert PestiCarb/NH2柱中加入約2cm高的無(wú)水硫酸鈉，用4mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）淋洗活化柱子。下接150mL梨形瓶，將上述復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至柱子中，用乙腈-甲苯溶液洗滌樣液瓶2次，每次5mL，并將洗滌液移入柱中。收集復(fù)溶液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40℃水浴蒸發(fā)濃縮至近干。最后用乙腈定容至1mL容量瓶中，供液相質(zhì)譜分析。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱Thermo Hypersil GOLD，粒徑1.9μm，規(guī)格100mm×2.1mm;進(jìn)樣量：10μL;柱溫：40℃;流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1。

質(zhì)譜條件：電離源模式，電噴霧離子化;電離源極性：正模式;霧化氣：氮?dú)?離子噴霧電壓：3 500V;離子傳輸管溫度：350℃;鞘氣壓力：45Arb;輔助氣壓力：15Arb;監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液量的優(yōu)化

采用玉米基質(zhì)，考察了乙腈的加液量對(duì)10種農(nóng)藥提取效率的影響。設(shè)置A、B、C、D四個(gè)試驗(yàn)組，分別在第一次提取、第二次提取時(shí)加入乙腈10mL、10mL;15mL、10mL;20mL、10mL;20mL、20mL。測(cè)定回收率見圖1。結(jié)果表明，A、B、C組中第二次加液量為10mL時(shí)，隨著第一次加液量的增加，各農(nóng)藥的回收率均顯著上升。由于干燥的樣品粉末在第一次提取時(shí)會(huì)吸收部分溶劑而溶脹，加液量不足會(huì)導(dǎo)致提取效果下降。而當(dāng)D組中第二次加液量增加至20mL時(shí)，回收率較C組無(wú)明顯上升。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇兩次提取液量分別為20mL和10mL。

2.2 固相萃取柱的選擇

采用玉米基質(zhì)，考察Cleanert S C18、Cleanert Florisil、Cleanert PestiCarb/NH2 3種固相萃取柱的組合使用對(duì)10種農(nóng)藥回收率的影響。Cleanert S C18是一種非極性的吸附劑，可去除提取液中脂肪等有機(jī)物;Cleanert Florisil是硅膠鍵合氧化鎂吸附劑，可去除色素和大分子物質(zhì);Cleanert PestiCarb/NH2固相萃取柱同時(shí)裝填有石墨化碳和氨基，可去除色素、脂肪酸、有機(jī)酸等干擾物質(zhì)?；谏鲜鲈恚O(shè)計(jì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組試驗(yàn)，分別對(duì)C18+PestiCarb/NH2、C18+Florisil和PestiCarb/NH2的凈化效果進(jìn)行研究。玉米基質(zhì)具有色素、油脂含量高的特點(diǎn)，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組Ⅱ最終定容液顏色較深且粘稠，凈化效果不理想，不適用于UPLC-MS/MS儀器分析。使用C18固相萃取柱的試驗(yàn)組Ⅰ，8種農(nóng)藥的回收率低于試驗(yàn)組Ⅲ（見圖2），其中毒死蜱由83%下降至75%，倍硫磷由88%下降至82%，這可能是因?yàn)镃leanert S C18在吸附雜質(zhì)的同時(shí)，對(duì)目標(biāo)化合物也有不同程度的吸附作用。綜合凈化效果和對(duì)農(nóng)藥回收率方面的影響，本研究最終選擇單獨(dú)使用PestiCarb/NH2固相萃取柱對(duì)基質(zhì)進(jìn)行凈化。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

分別用玉米、小麥、稻谷、大豆、綠豆和高粱的空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┮译媾渲葡嗤瑵舛忍荻鹊臉?biāo)準(zhǔn)溶液，以各農(nóng)藥的峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)（ME）數(shù)值用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比計(jì)算，ME<0.8表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng);0.8≤ME≤1.2表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng);ME>1.2表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。每一種農(nóng)藥在某些基質(zhì)中表現(xiàn)有強(qiáng)抑制或強(qiáng)增強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。因此，試驗(yàn)均采用基質(zhì)空白溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量分析，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 線性關(guān)系與靈敏度

分別用玉米、小麥、稻谷、大豆、綠豆和高粱6種空白基質(zhì)提取液，按照1.3.1配制0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）。研究表明，在不同基質(zhì)中，10種農(nóng)藥在0.1～4μg/mL線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。其中玉米基質(zhì)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限與定量限見表4。10種農(nóng)藥的LOQ范圍為0.15～3μg/kg，低于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2016）規(guī)定的農(nóng)藥最大殘留限量。

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

在玉米、小麥、稻谷、大豆、綠豆和高粱6種基質(zhì)中，對(duì)每種農(nóng)藥進(jìn)行20μg/kg、100μg/kg、400μg/kg三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定6次。結(jié)果表明，10種農(nóng)藥的平均回收率范圍為60.6%～113.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.21%～14.76%，準(zhǔn)確度和精密度均符合定量分析要求[16]。玉米基質(zhì)中10種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合固相萃取前處理技術(shù)，建立了谷物和油料中甲拌磷、倍硫磷、樂果、辛硫磷、三唑磷、乙硫磷、馬拉硫磷、甲基嘧啶磷、敵敵畏、毒死蜱共10種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法對(duì)提取液量和固相萃取柱進(jìn)行了優(yōu)化，前處理操作簡(jiǎn)單、凈化效果良好，儀器分析線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均滿足定量分析要求，在谷物和油料有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)中具有廣泛的適用性。

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