李祖成，王 月，趙 峰，王原超，楊 茗，李淑翠，王垣芳*

（1.濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，“方劑效應(yīng)與臨床評(píng)價(jià)”國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，山東煙臺(tái) 264003；3.濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003）

疼痛是許多疾病的常見癥狀,也是機(jī)體在受到傷害性刺激或損傷時(shí)產(chǎn)生的一種保護(hù)性的病理反應(yīng)。劇烈的疼痛不僅給患者造成痛苦,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致生理功能紊亂,甚至引起休克。目前臨床應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥主要包括非甾體類抗炎藥和阿片類藥物,非甾體類抗炎藥主要適用于治療輕、中度的慢性疼痛,但長期應(yīng)用消化道不良反應(yīng)發(fā)生率較高,有些新型的非甾體類抗炎藥物甚至可引起嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)和急性心血管不良事件；阿片類鎮(zhèn)痛藥鎮(zhèn)痛活性強(qiáng),但因易導(dǎo)致依賴性、成癮性,其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)格限制,主要用于治療急性劇烈疼痛和晚期癌癥疼痛。因此,尋找和研發(fā)毒副作用小的鎮(zhèn)痛藥是多年來醫(yī)藥界關(guān)注的重要課題,從傳統(tǒng)中藥中尋找鎮(zhèn)痛活性成分也成為近年來的熱點(diǎn)之一。

中藥鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草 （Commelina communisL.）的全草,其性寒,味甘、淡,具有清熱解毒、利水消腫之功效,用于治療跌打損傷、筋骨疼痛、小便淋漓作痛、風(fēng)熱感冒、高熱不退、咽喉腫痛、癰腫疔毒等病癥［1-2］。研究發(fā)現(xiàn),鴨跖草中含有黃酮類、生物堿類、萜類、甾醇類等多種化合物［3-4］。但是對(duì)于鴨跖草鎮(zhèn)痛作用有效部位及鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本研究采用輻射熱刺激甩尾法、醋酸扭體法觀察鴨跖草不同提取部位對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用,以探究其鎮(zhèn)痛活性部位,并通過阿片受體阻斷試驗(yàn)和檢測疼痛部位組織中的炎癥因子探討其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制,旨在為鴨跖草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量（20±2）g,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK （魯）20140007,動(dòng)物合格證號(hào)37009200012102。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,實(shí)驗(yàn)藥前及實(shí)驗(yàn)過程中均全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水,晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h,實(shí)驗(yàn)室溫度為25 ℃,相對(duì)濕度為40%。

1.1.2 藥物與試劑 鴨跖草（安徽易元堂中藥飲片科技有限公司,批號(hào)20150410）；阿司匹林腸溶片（每片100 mg,石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司,批號(hào)286160208）；鹽酸曲馬多緩釋片（每片100 mg,萌蒂［中國］制藥有限公司,批號(hào)10100706,成人單劑量50～100 mg）；鹽酸納洛酮注射液（規(guī)格2 mL ∶2 mg,批號(hào)20150906,成都苑東藥業(yè)有限公司）。小鼠組織前列腺E2（PGE2）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號(hào)20160530）、小鼠組織腫瘤壞死因子-α （TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號(hào)20160530）和小鼠組織白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號(hào)20160530）,均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 SW-200光熱尾痛測試儀（成都泰盟科技有限公司）；BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；UV-1901臺(tái)式高速微量離心機(jī)（北京科普順科技有限公司）；AN1574電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-400數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 鴨跖草不同提取部位的制備 稱取鴨跖草4.5 kg,粉碎制成粗粉,浸泡2 h,以70%乙醇進(jìn)行回流提取1 h,連續(xù)3次,將3次的提取液合并,回收溶劑,減壓濃縮直至無醇味,干燥后得鴨跖草浸膏49.85 g。將浸膏按硅膠與浸膏3 ∶1的比例混合攪勻,然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水進(jìn)行萃取,減壓,干燥,直至無溶劑殘留,得到石油醚提取部位（27.16 g）、乙酸乙酯提取部位（2.67 g）、正丁醇提取部位（7.28 g）和水溶部位（30 g）,計(jì)算各提取部位與生藥的比值,臨用前用蒸餾水配制成適當(dāng)質(zhì)量體積濃度的混懸液,置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 鴨跖草不同部位的鎮(zhèn)痛作用

2.2.1 輻射熱刺激甩尾法測定痛閾值［5］昆明種小鼠140只,雌雄各半,體質(zhì)量（20±2）g,按性別分籠,每籠10只,自由采食飲水。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7 d后,隨機(jī)分為14組,即生理鹽水組,鹽酸曲馬多組（0.013 g/kg）,鴨跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低劑量組 （30、15、7.5 g生藥量/kg）,給各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。

灌胃給藥前,將小鼠置入固定筒內(nèi),尾部暴露于外,實(shí)驗(yàn)前先用75%酒精擦凈尾部,在尾部中下1/3處做標(biāo)記作為光輻射刺激點(diǎn),然后將尾部標(biāo)記對(duì)準(zhǔn)光熱尾痛測試儀的光輻射孔,待小鼠安靜后測定甩尾潛伏期（光強(qiáng)75%）3次,每次間隔5 min,取3次的平均值作為基礎(chǔ)痛閾值。末次給藥后1 h,測試各小鼠給藥后的痛閾值。

2.2.2 醋酸扭體法測定痛閾值［5-6］昆明種小鼠140只,雌雄各半,體質(zhì)量（20±2）g,按性別分籠,每籠10只,自由采食飲水。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7 d后,隨機(jī)分為14組,即生理鹽水組,阿司匹林組（0.5 g/kg）,鴨跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g生藥量/kg）,給各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。末次給藥后1 h,給各鼠腹腔注射0.6%醋酸0.4 mL,觀察并記錄各鼠扭體反應(yīng)的潛伏期和15 min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.3 鴨跖草鎮(zhèn)痛有效部位的作用機(jī)制

2.3.1 阿片受體阻斷試驗(yàn) 經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)即可篩選出鴨跖草的鎮(zhèn)痛活性部位為水溶部位。昆明種雌性小鼠,體重（22±2）g,采用熱板法［5］（55±1）℃篩選痛閾值相近的小鼠30只,隨機(jī)分為3組,即1組（生理鹽水/納洛酮組）、2組（鴨跖草水溶部位/生理鹽水組）、3組（鴨跖草水溶部位/納洛酮組）,每組10只。2、3組分別灌服鴨跖草水溶部位（相當(dāng)于生藥30 g/kg）,1組灌服等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)7 d,末次給藥45 min后進(jìn)行如下處理。

鴨跖草水溶部位/生理鹽水組：腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g進(jìn)行預(yù)處理,15 min后再次灌服鴨跖草水溶部位；鴨跖草水溶部位/納洛酮組：用納洛酮0.1 mL/10 g（5 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行預(yù)處理,15 min后再次灌服鴨跖草水溶部位；生理鹽水/納洛酮組：腹腔注射生理鹽水進(jìn)行預(yù)處理,15 min后注射納洛酮（劑量同前）；末次給藥1 h后再次進(jìn)行熱板試驗(yàn),記錄舔后足潛伏期作為痛閾值（超過60 s者均按60 s計(jì)算）。

2.3.2 福爾馬林致痛試驗(yàn)局部組織中炎癥因子含有量測定

昆明種雌性小鼠,體質(zhì)量（22±+2）g,隨機(jī)分為6組,即生理鹽水組,阿司匹林組（500 mg/kg）,鹽酸曲馬多組（0.013 g/kg）,鴨跖草水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g生藥量/kg）,每組10只,連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥1 h后,于小鼠右足底皮下注射5%福爾馬林25 μL,然后放置于懸掛的1 000 mL燒杯內(nèi),觀察第一時(shí)相（0～10 min）和第二時(shí)相（15～30 min）舔咬右后足次數(shù)［5,7］。福爾馬林試驗(yàn)結(jié)束后6 h,將小鼠頸椎脫臼處死,剪取腫脹右足底組織并稱定質(zhì)量,按質(zhì)量容積比1 ∶9 （1 g ∶9 mL）的比例加生理鹽水,研磨成勻漿,于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,ELISA測定PGE2、TNF-α 和IL-6含有量。

3 結(jié)果

3.1 鴨跖草不同部位的鎮(zhèn)痛作用

3.1.1 鴨跖草提取部位對(duì)小鼠輻射熱刺激痛反應(yīng)的影響各給藥組的給藥前痛閾值（輻射熱刺激甩尾潛伏期）與生理鹽水組比較無顯著性差異（P＞0.05）。與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠給藥后痛閾值明顯增大（P＜0.01）；與自身給藥前及生理鹽水組比較,鴨跖草石油醚提取部位高劑量組（30 g/kg）和水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g/kg）痛閾值有不同程度增大 （P＜0.05,P＜0.01）,尤以水溶部位高、中劑量組最為顯著（P＜0.01）。見表1。

3.1.2 鴨跖草不同提取部位對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠扭體次數(shù)減少、扭體反應(yīng)潛伏期延長（P＜0.01）；鴨跖草石水溶部位高、中、低劑量組小鼠扭體次數(shù)減少,扭體反應(yīng)潛伏期延長（P＜0.05,P＜0.01）,其中水溶部位高、中劑量組扭體次數(shù)顯著減少,扭體反應(yīng)潛伏期顯著延長（P＜0.01）,見表2。

3.2 鴨跖草鎮(zhèn)痛有效部位的作用機(jī)制

3.2.1 納洛酮對(duì)鴨跖草水溶部位鎮(zhèn)痛作用的影響 鴨跖草水溶部位/生理鹽水組小鼠給藥后的痛閾值增大,即舔足潛伏期延長,與自身給藥前基礎(chǔ)痛閾值比較有顯著性差異（P＜0.01）；與生理鹽水/納洛酮組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與鴨跖草水溶部位/生理鹽水組比較,鴨跖草水溶部位/納洛酮組小鼠舔足潛伏期縮短（P＜0.05）；與自身給藥前基礎(chǔ)痛閾值比較,鴨跖草水溶部位/納洛酮組小鼠舔足潛伏期延長（P＜0.05）。見表3。

表1 鴨跖草不同提取部位對(duì)小鼠輻射熱刺激痛反應(yīng)的影響（， n=10）

表1 鴨跖草不同提取部位對(duì)小鼠輻射熱刺激痛反應(yīng)的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與自身給藥前比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

表2 鴨跖草不同提取部位對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響（， n=10）

表2 鴨跖草不同提取部位對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

表3 納洛酮對(duì)鴨跖草水溶部位鎮(zhèn)痛作用的影響（，n=10）

表3 納洛酮對(duì)鴨跖草水溶部位鎮(zhèn)痛作用的影響（，n=10）

注：與生理鹽水/納洛酮/組比較,*P＜0.05；與鴨跖草水溶部位/生理鹽水組比較,△P＜0.05；與自身給藥前基礎(chǔ)痛閾值比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.2.2 鴨跖草水溶部位對(duì)小鼠福爾馬林致痛的影響 與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠在第一時(shí)相（0～10 min）舔咬右后足次數(shù)無明顯減少 （P＞0.05）,在第二時(shí)相（15～30 min）舔咬右后足次數(shù)減少（P＜0.01）；鹽酸曲馬多組小鼠在第一相和第二相舔咬右后足次數(shù)均減少（P＜0.01）；鴨跖草水溶部位各劑量組小鼠在第一時(shí)相和第二時(shí)相舔咬右后足次數(shù)均減少（P＜0.01,P＜0.05）,且呈劑量依賴性。見表4。

表4 鴨跖草水溶部位對(duì)小鼠福爾馬林致痛的影響（，n=10）

表4 鴨跖草水溶部位對(duì)小鼠福爾馬林致痛的影響（，n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3.2.3 鴨跖草水溶部位對(duì)炎癥因子的影響 與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠右足底局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）；鴨跖草水溶部位高、中劑量組小鼠右足底局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）,其中以高劑量組的含有量降低最明顯（P＜0.01）,見表5。

表5 鴨跖草水溶部位對(duì)炎癥因子的影響（， n=10）

表5 鴨跖草水溶部位對(duì)炎癥因子的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

4 討論

疼痛是機(jī)體受到傷害性刺激和發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)所伴隨的癥狀,一般分為急性傷害性疼痛、炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛［8］。一定強(qiáng)度的熱刺激引起的疼痛為急性傷害性疼痛［6］。小鼠尾部對(duì)熱刺激特別敏感,當(dāng)受到一定強(qiáng)度的熱刺激時(shí),痛覺信號(hào)傳導(dǎo)至神經(jīng)中樞,再反饋到運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)即可出現(xiàn)甩尾的保護(hù)性反應(yīng),因此熱刺激時(shí)小鼠出現(xiàn)甩尾的潛伏期可反映痛閾值［5］。醋酸扭體法是通過給小鼠腹腔注射一定容積和濃度的醋酸,刺激腹膜引起炎性疼痛,從而出現(xiàn)扭體反應(yīng),該反應(yīng)在注射15 min內(nèi)出現(xiàn)頻率最高,故以注射15 min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)或發(fā)生反應(yīng)的潛伏期作為疼痛指標(biāo)［5,9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鴨跖草水溶部位可明顯提高小鼠熱刺激痛閾值,減少小鼠醋酸致痛的扭體反應(yīng)次數(shù)；石油醚提取部位高劑量具有一定的提高痛閾值作用,而石油醚提取部位中、低劑量和乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位各劑量均無明顯作用,提示鴨跖草的水溶性部位為鴨跖草的鎮(zhèn)痛活性部位。

福爾馬林致痛試驗(yàn)是目前國際公認(rèn)的用于研究藥物鎮(zhèn)痛作用的常用方法［10］,適用于篩選鎮(zhèn)痛作用較弱的藥物,其致痛刺激較為持久,且疼痛反應(yīng)的兩個(gè)時(shí)相分別代表不同性質(zhì)的疼痛。第一時(shí)相（0～10 min）反應(yīng)為福爾馬林直接刺激傷害性感受器,引起C纖維興奮而出現(xiàn)急性傷害性疼痛,其特點(diǎn)為短暫的急痛反應(yīng),表現(xiàn)為舔足、縮足或抬足反射等行為反應(yīng)；第二時(shí)相（15～30 min）反應(yīng)則是由于第一階段引起的中樞敏化和外周炎癥共同參與所致［10-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鴨跖草水溶部位對(duì)小鼠福爾馬林致痛試驗(yàn)的第一時(shí)相和第二時(shí)相反應(yīng)均有抑制作用,提示鴨跖草水溶部位對(duì)傷害性刺激引起的急性傷害性疼痛和炎癥反應(yīng)引起的炎性疼痛均有抑制作用。

TNF-α、IL-6、PGE2是重要的致炎因子。組織損傷時(shí),受損的組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞可釋放TNF-α、IL-6和PGE2等炎癥介質(zhì),引起炎癥反應(yīng)和疼痛［13-15］；PGE2還可直接刺激痛覺感受器引起疼痛［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給小鼠足底注射福爾馬林可引起局部組織中PGE2、TNF-α 和IL-6釋放增加,表明注射部位發(fā)生了炎癥反應(yīng)；鴨跖草水溶部位能使局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低,且呈劑量相關(guān)性,提示鴨跖草水溶部位具有抑制炎癥反應(yīng)和減輕炎性疼痛的作用。

阿片受體是內(nèi)源性阿片肽和阿片類藥物產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的重要靶點(diǎn)。納洛酮為阿片受體拮抗劑,可競爭性拮抗阿片肽和阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用［16-17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,納洛酮能使鴨跖草水溶部位的鎮(zhèn)痛作用有所減弱,提示鴨跖草水溶部位的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能部分與激動(dòng)阿片受體有關(guān)。

本研究結(jié)果提示,鴨跖草的水溶部位為鴨跖草的鎮(zhèn)痛活性部位,對(duì)于傷害性疼痛的鎮(zhèn)痛作用可能與阿片受體有關(guān)；對(duì)于炎癥性疼痛的鎮(zhèn)痛作用可能與減少前列腺素等致炎因子有關(guān)。