楊鵬飛 楊成宇林 玲胡建慧周 瑩孫小祥夏國(guó)華楊 歡*

（1.常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院，江蘇常州 214000；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212003）

僵蛹為蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶Bombyx moriL.的蛹接種白僵菌Beauveria bassiana發(fā)酵后的制品,常作為僵蠶的代用品,可用于治療高熱驚厥、癲癇、上呼吸道感染、流行性腮腺炎等,還具有抗凝、抗癌和其他藥理作用［1］。

僵蠶（蛹）的應(yīng)用廣泛,需求量大,市面上出現(xiàn)了一些偽品,如感染綠僵菌Metarhizium anisopliae致死的家蠶和黑死蠶等［2］,對(duì)臨床用藥的安全性和有效性造成了負(fù)面影響。目前以僵蛹入藥的臨床常用中成藥有天蠶膠囊和天蠶片,傳統(tǒng)的性狀與顯微鑒別方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)其中僵蛹成分的準(zhǔn)確鑒定。DNA分子鑒定技術(shù)對(duì)不同物種具有高度特異性,比傳統(tǒng)鑒定方法更為可靠［3］,近年來(lái)在中藥鑒定領(lǐng)域備受關(guān)注。如DNA條形碼技術(shù),是利用DNA片段自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性對(duì)物種進(jìn)行鑒定［4-7］,結(jié)果準(zhǔn)確度高,但是產(chǎn)物需要測(cè)序,操作步驟繁瑣,尤其是不適用于混合物；而特異性引物擴(kuò)增是根據(jù)基因序列存在的差異所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR,在樣品檢驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需測(cè)序,可同時(shí)測(cè)定多個(gè)物種,且適用于混合物,彌補(bǔ)了DNA條形碼技術(shù)的不足［8-9］。

本研究根據(jù)僵蛹中家蠶和白僵菌及其常見(jiàn)偽品綠僵菌的線粒體全基因（mtDNA）序列的差異設(shè)計(jì)引物,進(jìn)而基于特異性引物擴(kuò)增建立了具有較強(qiáng)專屬性且能夠簡(jiǎn)便快速地檢測(cè)天蠶片和天蠶膠囊中僵蛹成分的技術(shù),以期為市面中成藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 恒溫混勻儀（拓普森科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHZ型恒溫振蕩器（國(guó)華電器有限公司）；NanoDrop 1000型核酸蛋白分析儀 （美國(guó)Thermo公司）；T100型PCR儀、Basic型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；JY-SPFT型水平電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；GenoSens 1860型凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 白僵菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,保藏編號(hào)為CICC41021；綠僵菌購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,保藏編號(hào)為BNCC 114445；家蠶對(duì)照藥材（B/N 121457-200501）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；中成藥天蠶片、天蠶膠囊購(gòu)自藥房,具體信息見(jiàn)表1；蠶蛹由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。Tris平衡酚（北京索萊寶科技有限公司）；dNTP Mix、DreamTaq Green DNA Polymerase （美國(guó)Thermo公司）；Agarose-Low EEO （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Ethidium Bromide （美國(guó)Sigma公司）；Low ladder SN127 （南京生興生物技術(shù)有限公司）為生物級(jí)；其他試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 自制僵蛹 參考文獻(xiàn)［10］,稱取蠶蛹粉10.0 g,加10 mL水混勻,121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫,作為發(fā)酵基質(zhì)。無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行白僵菌液接種,（27±1）℃培養(yǎng),15 d后,待基質(zhì)內(nèi)外長(zhǎng)滿菌絲體時(shí)取出,60 ℃干燥24 h,制得10批白僵蛹（BJ1～BJ10）。同法自制10批綠僵蛹（LJ1～LJ10）和10批不接菌種的空白蠶蛹（NJ1～NJ10）。

2.2 供試品溶液制備 稱取家蠶對(duì)照品、白僵菌、綠僵菌、自制僵蛹各20.0 mg,加入CTAB提取液1 000 μL,65 ℃孵育2 h后離心,上清液加入等體積70%甲醇,充分混勻,置于-20 ℃下冷凍1 h,離心,待甲醇揮干后,加入CTAB提取液500 μL,65 ℃孵育1 h,離心,上清液加入等體積的三氯甲烷/Tris-飽和酚（1 ∶1）,混勻,離心,加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）,混勻,離心,加入3 mol/L醋酸鉀溶液100 μL,再加入與上清液等體積的預(yù)冷異丙醇,混勻后置于-20 ℃下冷凍1 h,離心,沉淀中加入預(yù)冷的70%乙醇500 μL洗滌后,室溫晾干,以TE緩沖液25 μL溶解,得到DNA供試品溶液,4 ℃保存。

2.3 特異性引物設(shè)計(jì) 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索下載家蠶、白僵菌及其常見(jiàn)偽品綠僵菌的線粒體全基因組序列,并采用DNAMAN軟件比對(duì)3個(gè)物種的基因差異,利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)特異性引物,并通過(guò)NCBI Primer-BLAST評(píng)估,特異性引物的序列等信息如表2所示。

表2 特異性引物

2.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系由以下成分組成［11］：1×擴(kuò)增緩沖液,200 μmol/L dNTPs,引物對(duì)1.0 μL （正向與反向各半）,1 μL模板DNA （10 ng）,Taq DNA聚合酶0.625 U,200 μmol/L MgCl2,再加入無(wú)菌雙蒸水至25 μL。反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物載入2%TBE瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離,紫外下觀察目的片段條帶。研究中還優(yōu)化了退火溫度、引物濃度以及循環(huán)數(shù)等,最終建立了PCR擴(kuò)增條件,見(jiàn)表3。

表3 PCR擴(kuò)增條件

2.5 特異性及靈敏度 將不同批3種自制樣品在“2.4”項(xiàng)條件下與3種特異性引物（PM、PB、PA）進(jìn)行擴(kuò)增以驗(yàn)證特異性。圖1顯示,家蠶、白僵菌的DNA經(jīng)擴(kuò)增后分別在61、94 bp處產(chǎn)生條帶,而綠僵菌的DNA經(jīng)擴(kuò)增后,在144 bp處產(chǎn)生條帶；各引物之間無(wú)交叉反應(yīng),體現(xiàn)出了很強(qiáng)的專屬性。

保持引物PM、PB、PA的濃度均為0.2 μmol/L,分別加入0.01、0.1、1、10 ng/μL DNA模板各1 μL,進(jìn)行PCR以考察靈敏度。從圖2中可以看出,在以特異性引物PM或PA擴(kuò)增時(shí),如DNA模板質(zhì)量濃度分別為1、10 ng/μL,可檢出目的片段條帶；引物PB在模板質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1 ng/μL時(shí)均能檢出條帶,故對(duì)家蠶和綠僵菌的檢出限為1 ng,而對(duì)白僵菌的檢出限為0.1 ng。

圖2 靈敏度檢測(cè)電泳圖

2.6 自制僵蛹檢測(cè) 以特異性引物PM、PB和PA對(duì)20批自制僵蛹和10批空白蠶蛹進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以考察該技術(shù)的準(zhǔn)確性。從圖3可以看出,10批白僵蛹及其常見(jiàn)偽品綠僵蛹的DNA經(jīng)擴(kuò)增后,產(chǎn)生的條帶位置與預(yù)期目的片段的長(zhǎng)度一致。

圖3 自制僵蛹的檢測(cè)電泳圖

2.7 天蠶片和天蠶膠囊檢測(cè) 通過(guò)本研究所建立的技術(shù)對(duì)3批天蠶片以及3批天蠶膠囊中的僵蛹成分進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證標(biāo)簽所示物種是否準(zhǔn)確。分別精密稱取6批中成藥樣品粉末20.00 mg,按“2.2” 項(xiàng)下方法提取與純化DNA,然后在“2.4” 項(xiàng)條件下擴(kuò)增。由圖4、表4可見(jiàn),這6批市售中成藥經(jīng)均檢出了僵蛹的基原家蠶和白僵菌,并且未檢測(cè)出綠僵菌。

圖4 天蠶膠囊及天蠶片的檢測(cè)電泳圖

表4 天蠶片和天蠶膠囊鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

研究表明生命體中mtDNA較為豐富,比細(xì)胞核DNA等其他遺傳標(biāo)記更適合物種鑒定；同時(shí),多拷貝mtDNA在加工產(chǎn)物中比單拷貝核DNA有更高的存活機(jī)會(huì),有助于提高分析靈敏度［12-14］。本研究基于mtDNA種間差異設(shè)計(jì)的特異性引物能同時(shí)檢出家蠶、白僵菌及其常見(jiàn)偽品基原綠僵菌,且引物間無(wú)交叉反應(yīng),體現(xiàn)出很強(qiáng)的專屬性。

研究表明蛹相比幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的微生物豐富度更高［15］,因此開(kāi)展蛹的質(zhì)量控制技術(shù)研究具有一定意義。本研究利用特異性擴(kuò)增技術(shù)鑒定了天蠶片和天蠶膠囊中的僵蛹成分,該技術(shù)準(zhǔn)確可靠,且方便快速,有助于監(jiān)控含僵蠶（蛹）中成藥的質(zhì)量。

本研究考慮到僵蛹與僵蠶的基原一致,而天蠶片和天蠶膠囊僅含有僵蛹,是成分最為簡(jiǎn)單的臨床常用中成藥,因而被選擇作為研究對(duì)象,而沒(méi)有選擇其他較為復(fù)雜的含有僵蠶成分的成方制劑。在目前正在進(jìn)行的工作中,課題組已經(jīng)選擇了含有僵蠶的中成藥金嗓清音丸和中風(fēng)回春丸作為研究對(duì)象,這2種中成藥的成分復(fù)雜,開(kāi)展專屬性鑒定研究更具意義。

中成藥中同時(shí)含有多種動(dòng)物藥成分,由于制法復(fù)雜、輔料干擾,其鑒定難度很大,在后續(xù)的工作中將進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究,優(yōu)化測(cè)定條件,建立專屬性鑒定技術(shù)以期從中成藥中同時(shí)鑒定多種動(dòng)物藥成分。

本研究的鑒定依據(jù)為DNA分子,因而無(wú)法實(shí)現(xiàn)僵蠶和僵蛹區(qū)別,也無(wú)法用于鑒別添加染了白僵菌的蠶沙等制偽現(xiàn)象,在后續(xù)工作中考慮結(jié)合使用差異性蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)或者采用DNA定量擴(kuò)增技術(shù)開(kāi)展進(jìn)一步研究。