劉夢(mèng)婷，羅飛亞，曾建國(guó)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，中獸藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128）

飼料在長(zhǎng)期貯存中易產(chǎn)生氧化、腐爛及霉變現(xiàn)象,導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低［1］。為了延長(zhǎng)飼料的貯存時(shí)間,常常在飼料中添加抗氧化劑、防腐劑和防霉劑,但目前使用的飼料添加劑多是化學(xué)類添加劑［2-3］。由于過(guò)多地使用此類添加劑,動(dòng)物源食品已經(jīng)嚴(yán)重受到污染,進(jìn)而影響到人類的健康。而植物精油是從從植物中提取的一類天然物質(zhì),不僅具有較強(qiáng)的抗菌抗氧化作用［4-5］,更由于其綠色安全的特點(diǎn)被越來(lái)越多的人關(guān)注。研究表明,在仔豬飼料中添加牛至油,可提高平均日增重,同時(shí)提高飼料轉(zhuǎn)化率,且治療仔豬下痢也有很好的療效［6］。在肉雞基礎(chǔ)日糧中分別添加植物精油,對(duì)42 d齡肉仔雞的血清抗氧化指標(biāo)有正向調(diào)節(jié)作用,表明植物精油在清除自由基方面有一定的作用［7］。柴向華等［8］通過(guò)測(cè)定抑菌圈等體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究了羅勒精油、百里香精油、牛至精油等13種植物精油對(duì)6種常見(jiàn)有害微生物的抑菌作用。結(jié)果表明,13種植物精油均對(duì)細(xì)菌、真菌、霉菌具有一定的抑殺能力。因此,植物精油的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景十分廣闊。

石香薷Mosla chinensisMaxim.系唇形科石薺苧屬一年生草本植物,有細(xì)葉香薷、小香薷、野香薷等別稱,廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)。石香薷在民間以全草入藥,具有治療中暑發(fā)熱、感冒惡寒、胃痛嘔吐、急性腸胃炎、痢疾等作用［9］。石香薷精油是從石香薷全草中提取的揮發(fā)油,具有濃烈的香氣。研究表明石香薷精油具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性［10-11］,目前對(duì)石香薷精油的應(yīng)用報(bào)道主要集中在植物殺蟲(chóng)劑方面［12-13］,但其在飼料添加劑方面的應(yīng)用報(bào)道較少。本研究通過(guò)GC-MS法分析石香薷精油中的化學(xué)成分,并研究其抗菌、抗氧化活性,旨在尋找一種天然高效的飼料添加劑,同時(shí)也為充分開(kāi)發(fā)利用石香薷提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV2400型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；Nano Quant infinite M200Pro TECAN酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ZHWY-103D型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（北京市永安光明醫(yī)療儀器廠）；LDZF-75KB-Ⅱ型立體蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC/MS solution色譜工作站和NIST.17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（日本島津公司）；移液槍（Gilson PIPETMAN?L手動(dòng)單道移液器,法國(guó)Gilson公司）。

1.2 材料 石香薷干燥全草（湖南新寧）,經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾建國(guó)教授鑒定為正品。DPPH （50 mg/瓶）、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；吐溫-80；無(wú)水硫酸鈉（分析純,500 g/瓶,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸丙酯 （PG,化學(xué)純,100 g/瓶）、抗壞血酸 （Vc,1 g/瓶,阿拉?。?；正己烷（色譜純,德國(guó)Merck公司）；無(wú)水乙醇（分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；TPYPTONE （胰蛋白胨）、YEAST EXTRACT （酵母粉）,均購(gòu)于美國(guó)OXOID公司；氯化鈉（分析純）、瓊脂粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,所有供試菌種均來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保究藏中心（CCTCC）。鹽酸金霉素（純度94.1%,生產(chǎn)批號(hào)130306-201419,中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 石香薷精油提取 將石香薷干燥全草切斷（1 cm左右）,稱取200 g,用水蒸氣蒸餾裝置提取樣品中的精油,同時(shí)考察時(shí)間對(duì)精油提取的影響；將精油收集后用無(wú)水硫酸鈉干燥并裝瓶于低溫處保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 石香薷精油成分測(cè)定 CD-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；注入方式無(wú)分流；載氣高純氦氣 （99.99%）；載氣氣體體積流量1 mL/min。程序升溫條件為初始溫度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,繼續(xù)以5 ℃/min升至200 ℃,保持2 min,分析檢測(cè)時(shí)間共計(jì)61 min。

離子源為EI源；離子源溫度為200 ℃；接口溫度為220 ℃；電離能量為70 eV；質(zhì)荷比質(zhì)量掃描范圍為m/z45～500；溶劑切除時(shí)間2.5 min,采集時(shí)間為58.5 min。

2.3 石香薷精油抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 對(duì)DPPH·清除率 準(zhǔn)確稱取0.019 7 g DPPH·溶解于無(wú)水乙醇中,定容于250 mL棕色量瓶中,即配制成2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,低溫儲(chǔ)藏備用；另取適量精油用無(wú)水乙醇溶解,分別配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、40、80 μg/mL的精油乙醇溶液,低溫儲(chǔ)藏備用。

參照文獻(xiàn)［14-15］中的方法。吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,再加入2 mL無(wú)水乙醇,至于具塞試管中,記作A0；另取2根具塞試管各加入2 mL 1 μg/mL的精油溶液,然后分別加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液、2 mL無(wú)水乙醇溶液,分別記作Ai和Aj。用力搖勻。將A0、 Ai、 Aj所表示的樣品在室溫暗處?kù)o置反應(yīng)30 min,加入比色皿中在波長(zhǎng)517 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定,以無(wú)水乙醇作為對(duì)照調(diào)零,分別測(cè)出A0、 Ai和Aj所示樣品的吸光度值。同理分別測(cè)定出5、10、20、40、80 μg/mL的精油溶液的吸光度值,并用PG和Vc做陽(yáng)性對(duì)照。石香薷精油的清除率（SR）計(jì)算公式為SR=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%。

2.3.2 總抗氧化能力（FRAP法）參照文獻(xiàn)［16-17］進(jìn)行。96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μL FRAP工作液,空白對(duì)照孔中加入5 μL蒸餾水,樣品檢測(cè)孔內(nèi)分別加入5 μL 0.1%石香薷精油溶液。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm處測(cè)定其吸光度。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品的總抗氧化能力以FRAP值來(lái)表示,1 FRAP值與1 mmol/L FeSO4相當(dāng)。

2.4 抗菌活性 采用濾紙片擴(kuò)散法［18-19］,將一定量的石香薷精油用1%吐溫-80水溶液稀釋成25%精油溶液。在無(wú)菌條件下,將濾紙片（d=6 mm）浸入已配置好的精油溶液中,取出自然風(fēng)干,貼到涂抹適宜濃度菌懸液（1×106～107CFU/mL）的培養(yǎng)基平板上,每皿2片并以吐溫-80水溶液作對(duì)照,重復(fù)3次,37 ℃培養(yǎng)12 h,十字交叉法測(cè)定抑菌圈大?。?0-21］。

2.5 最低抑菌濃度（MIC）采用二倍稀釋法［22］,將石香薷精油用1% 吐溫-80水溶液稀釋成體積分?jǐn)?shù)為160 μL/mL的溶液。取無(wú)菌試管10支,排成一排,編號(hào)1～10。除1號(hào)管中加入1.6 mL LB培養(yǎng)基,其余各管各加入1 mL。然后再加入0.4 mL精油溶液至1號(hào)管,混勻,從1號(hào)管中吸取1 mL液體加入至2號(hào)管,混勻后吸取1 mL加入3號(hào)管,以此類推,8號(hào)管中吸取1 mL液體棄去。9號(hào)管為不含精油溶液的生長(zhǎng)對(duì)照,10號(hào)管為空白對(duì)照。然后在1～8號(hào)每管內(nèi)加入菌液1 mL,使精油體積分?jǐn)?shù)最終為0.125～16 μL/mL,最終菌液濃度為1×106～107CFU/mL。將接種好的試管,于37 ℃培養(yǎng)6 h,然后吸取100 μL涂布瓊脂平板,再于37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察,無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的為最低抑菌濃度。

精確稱取鹽酸金霉素適量,制備成質(zhì)量濃度為5.12 mg/mL的母液,參照石香薷精油二倍稀釋法進(jìn)行稀釋,取無(wú)菌試管10支,編號(hào)1～10。使1～8號(hào)管鹽酸金霉素質(zhì)量濃度最終為4～512 μg/mL,9號(hào)管為不含鹽酸金霉素溶液的生長(zhǎng)對(duì)照,10號(hào)管為空白對(duì)照。將接種好的試管,于37 ℃培養(yǎng)6 h,然后吸取100 μL涂布瓊脂平板,再于37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的為最低抑菌濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 石香薷精油提取及化學(xué)成分分析 測(cè)定結(jié)果表明,石香薷精油的提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,當(dāng)時(shí)間達(dá)到4 h后,提取率不再提高。本研究中石香薷精油的提取率為1.72%～1.85% （實(shí)際生產(chǎn)中,影響石香薷精油提取率的因素還有料液比、粉碎粒度、原料浸泡時(shí)間等）。總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 石香薷精油總離子流圖

采用面積歸一化法對(duì)各積分色譜峰占總峰面積百分比進(jìn)行計(jì)算,再將GC-MS獲取的石香薷精油成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過(guò)NIST.17譜庫(kù)檢索和人工仔細(xì)比對(duì),參考文獻(xiàn)［11-12］,本研究從石香薷精油中共檢測(cè)出52種成分,鑒定了其中32種,見(jiàn)表1,相似度均達(dá)到84%以上,占總峰面積的97.84%。其中百里香酚、對(duì)傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯是其主要成分。

表1 石香薷精油化學(xué)成分鑒定結(jié)果

3.2 結(jié)果分析

3.2.1 總抗氧化能力 FRAP法測(cè)定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原（Fe3+-TPTZ）復(fù)合物,產(chǎn)生藍(lán)紫色的（Fe2+-TPTZ）,利用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度,其變化與還原物質(zhì)的含有量呈比例關(guān)系,并在593 nm處達(dá)到最大吸收,因此可作為樣品總抗氧化能力的指標(biāo)［23-24］。

由FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,其在0.15～1.5 mmol/L之間線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=0.351 9X+0.019 8 （r=0.998 2）,通過(guò)對(duì)石香薷精油總抗氧化能力測(cè)定,計(jì)算得出石香薷精油的總抗氧化能力的FRAP值為327.08±1.92,結(jié)果表明石香薷精油的抗氧化能力較強(qiáng)。

3.2.2 DPPH·清除 由圖2可知,石香薷精油的IC50為1.92 μg/mL。石香薷精油對(duì)DPPH·的清除率與精油濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,當(dāng)石香薷精油的質(zhì)量濃度到20 μg/mL時(shí),對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到飽和,而總體來(lái)看,石香薷精油的清除率要高于同質(zhì)量濃度的PG和Vc溶液?？寡趸瘎┍憩F(xiàn)出來(lái)的抗氧化活性大小一般是酚類＞醛類＞醇類,石香薷精油中的化學(xué)成分以百里香酚、對(duì)傘花烴、香芹酚等為主要物質(zhì),因此有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

圖2 石香薷精油對(duì)DPPH·的清除率

3.3 石香薷精油及鹽酸金霉素的抑菌活性結(jié)果分析

3.3.1 抑菌活性 石香薷精油的抑菌活性結(jié)果見(jiàn)表2,石香薷精油對(duì)4種供試菌均有抑制作用,抑菌活性強(qiáng)弱為金黃色葡萄球菌＞腸炎沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,對(duì)大腸桿菌抑制效果較弱。

表2 石香薷精油對(duì)不同菌種的抑菌活性（）

表2 石香薷精油對(duì)不同菌種的抑菌活性（）

3.3.2 石香薷精油和鹽酸金霉素的MIC測(cè)定結(jié)果 表3顯示,生長(zhǎng)對(duì)照號(hào)管供試菌種正常生長(zhǎng),表明1%吐溫-80溶液對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用,空白對(duì)照管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),表明培養(yǎng)基未受到污染。由于不同菌種對(duì)石香薷精油的敏感程度不同,最低抑菌體積分?jǐn)?shù)也各不相同。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌的MIC值為1 μL/mL,大腸桿菌的MIC值為2 μL/mL?？梢?jiàn),石香薷精油對(duì)其均有良好的抑制作用。

見(jiàn)表4顯示,生長(zhǎng)對(duì)照管供試菌種正常生長(zhǎng),表明蒸餾水對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用,空白對(duì)照管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),表明培養(yǎng)基未受到污染。由于不同菌種對(duì)鹽酸金霉素的敏感程度不同,最低抑菌體積分?jǐn)?shù)也各不相同。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌的MIC值分別為128、8、32、64 μg/mL。可見(jiàn),鹽酸金霉素對(duì)不同菌種的抑制效果各不相同,其中對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用。

表3 石香薷精油體外對(duì)4種病原菌MIC值

表4 鹽酸金霉素對(duì)4種病原菌的MIC值

4 討論

石香薷是我國(guó)重要的一種含有較多揮發(fā)油的植物,其精油含有量隨著其生長(zhǎng)期、部位及提取工藝的不同有較大差異［24-26］。本研究中石香薷精油的提取率為1.72%～1.85%,精油提取率較高。

本研究通過(guò)GC-MS分析石香薷精油化學(xué)成分,結(jié)果表明其成分以萜烯類為主,主要成分為百里香酚、對(duì)傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯、香芹酚等,和已報(bào)道結(jié)果相似［27-28］,張瀟月等［29］研究報(bào)道,石香薷化學(xué)成分中未檢測(cè)對(duì)傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯,而百里香酚和香芹酚含有量相對(duì)較高,可能是由于地域性差異導(dǎo)致?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示石香薷精油清除DPPH·的能力與其濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,表明其有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化能力。通過(guò)測(cè)定石香薷精油對(duì)4種細(xì)菌的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)石香薷精油對(duì)不同種類細(xì)菌具有良好的抑菌活性,尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌展現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,而石香薷精油中的帖烯類物質(zhì)可能在其較強(qiáng)的抗菌抗氧化能力而發(fā)揮主要作用［30-31］。在設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照中,其抑菌效果不明顯,僅對(duì)金黃色葡萄球菌具有一般抑菌效果,對(duì)其他3種菌的抑制效果較差,石香薷精油抑菌效果明顯優(yōu)于鹽酸金霉素。

本研究表明石香薷精油具有良好的抗菌抗氧化作用,可作為一種新的天然、綠色、無(wú)毒的飼料添加劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用,前景廣闊。同時(shí)希望通過(guò)更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油［32-33］,以便在將來(lái)替代化學(xué)類添加劑應(yīng)用于人們生活中的各個(gè)領(lǐng)域,有利于人類健康。