張 凡 孟 莉 劉蓬蓬王 旭王 銳宋 成賈天柱*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600）

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮。其味苦,性寒,歸腎、膀胱、大腸經(jīng),具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效,為中醫(yī)傳統(tǒng)的清熱燥濕藥［1］?！侗静菥V目》 載有“黃檗性寒而沉,生用則降實火,熟用則不傷胃,酒炙則治上,鹽炙則治下,蜜炙則治中”。這是對黃柏炮制作用最精辟的論述。生黃柏具苦寒之性,清熱燥濕作用強(qiáng),酒炙緩和苦寒之性,而鹽炙則增強(qiáng)苦寒之性,又引藥下行入腎,還可增強(qiáng)滋陰降火的作用。此外在其他醫(yī)書中,針對黃柏的鹽炙也有相關(guān)的記載。黃柏經(jīng)鹽炙后可引藥下行入腎,其滋腎陰、瀉腎火、退虛熱的功效增強(qiáng),可用于陰虛發(fā)熱、夢遺滑精、骨蒸勞熱、盜汗、咳嗽咯血等證。而目前黃柏的“鹽炙入腎”的炮制理論仍然停留在傳統(tǒng)表述之中,并無現(xiàn)代科研數(shù)據(jù)支撐。本實驗通過大鼠腎組織中對黃柏有效成分的吸收差異,對其“鹽炙入腎” 的理論進(jìn)行驗證［2］。

黃柏中富含生物堿類及少部分檸檬苦素類成分,其中生物堿類包含小檗堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿等,這些都是黃柏中具有代表性的活性成分,具有清熱、抗炎、降血壓等功效［3］。此外,除生物堿成分,黃柏還含有少量的檸檬苦素類成分,如黃柏酮和黃柏內(nèi)酯等［4］。本實驗擬通過對黃柏生品及鹽炙品的水煎液進(jìn)行大鼠灌胃給藥后,并分別在不同時間點摘取其腎組織,采用液質(zhì)聯(lián)用的方法對腎組織臟器中生物堿類成分進(jìn)行含有量測定,從而分析黃柏生制品在腎組織臟器的吸收差異。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQD超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀 （美國Waters公司）；METTLER AE240型分析天平（十萬分之一,瑞士Mettler公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FSH-2可調(diào)高速電動勻漿器（江蘇佳美儀器有限公司）；XW-80A渦旋混合器 （上海青浦滬西儀器廠）；Thermo Fisher Finnpipette Steppers單道連續(xù)分配移液器（芬蘭雷勃公司）；HGC-12A氮吹儀（天津恒奧科技有限公司）；Milli-Q純水儀（德國Millipore公司）。

1.2 試劑與藥物 黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、尼莫地平對照品（大連美倫生物技術(shù)有限公司,批號分別為M0107AS、M0717AS、B0613AS、S0913AS、J0918AS、M0503AS）；質(zhì)譜級甲醇、乙腈、色譜級甲醇（美國Sigma公司）；水為超純水,無碘鹽（大連鹽業(yè)有限公司）；其他試劑均為高級分析純。

1.3 藥材 黃柏藥材采自四川省雅安市滎經(jīng)縣,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮。

2 方法

2.1 實驗動物 SD雄性大鼠66只,體質(zhì)量180～200 g,6～8周齡,遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供,許可證號SCXK （遼）2010-0001。在正式實驗前,大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,預(yù)飼養(yǎng)期間自由飲食飲水,室溫（22±2）℃,濕度（60±2）%。

2.2 黃柏生制炮制制備

2.2.1 生黃柏制備 取黃柏原藥材,洗凈,潤透,切細(xì)絲,干燥,既得。

2.2.2 鹽黃柏制備 取凈制后的黃柏絲,放入適宜的容器中,加適量鹽水拌勻,悶潤2 h,待黃柏吸進(jìn)輔料鹽水后取出。在炒制容器內(nèi)于150～160 ℃下,炒制6 min,取出,放涼,即得。每100 g黃柏加2 g鹽,30%蒸餾水［5］。

2.3 給藥水煎液制備 分別取黃柏生品和鹽炙品適量置于煎藥鍋中,先加入10倍量水浸泡30 min,而后煎煮60 min,濾過；此后藥渣再加入8倍量水,再次煎煮60 min,濾過。合并2次濾液,水浴濃縮至質(zhì)量濃度為1 g/mL［6-7］。

2.4 給藥方案及樣品采集 66只大鼠隨機(jī)分成2組,分別為生黃柏組30只,鹽黃柏組30只,空白組6只。各組給藥體積為10 mL/kg,灌胃給予相應(yīng)黃柏炮制品藥液。分別于0.5、1、3、6、9 h時間點上,每組脫頸椎處死6只動物,立即取出腎臟組織,生理鹽水沖洗干凈,用濾紙吸干表層水分,分裝于自封袋中,置-80 ℃冰箱中保存待測。

2.5 溶液制備

2.5.1 對照品溶液 精密稱取黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿對照品適量,置50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制備成質(zhì)量濃度分別為74.8 μg/mL的黃柏堿、63.4 μg/mL的黃柏堿、63.2 μg/mL的藥根堿、60.1 μg/mL的巴馬汀、61.2 μg/mL的小檗堿對照品貯備液,置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取尼莫地平對照品適量,置50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制備成質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液,并置于4 ℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 腎組織樣品處理 精密稱量腎組織樣品200 mg,剪碎后,加入2 mL生理鹽水,用組織勻漿機(jī)處理。之后以4 000 r/m離心,取上清組織勻漿液100 μL,加內(nèi)標(biāo)溶液10 μL,渦旋混合30 s,再加入乙腈400 μL,渦旋混合180 s,12 000 r/m離心10 min后,取上清液。將上清溶液,于35 ℃氮氣吹干,殘渣加入乙腈-水（1 ∶1）混合溶液100 μL復(fù)溶,渦旋混勻3 min進(jìn)行混勻,最后以12 000 r/m冷凍離心5 min,取上清液5 μL進(jìn)樣分析［8-9］。

2.7 分析條件

2.7.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸水（A）-0.1% 甲酸乙腈（B）,梯度洗脫,程序見表1；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.7.2 質(zhì)譜條件 采用ESI源；正離子MRM模式檢測；離子源能量3.0 kV,采樣錐電壓50 V,離子源溫度150 ℃,脫溶劑溫度450 ℃；錐孔氣體體積流量50 L/h,脫溶劑氣體體積流量900 L/h。

2.8 分析方法確證

2.8.1 專屬性試驗 黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿和內(nèi)標(biāo)物尼莫地平成分在ESI正離子電離方式下,主要生成［M+H］+離子峰,分別為m/z342.17,m/z342.18,m/z338.15,m/z352.15,m/z336.07,m/z419.21。選擇性對［M+H］+離子進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析,上述指標(biāo)性成分和內(nèi)標(biāo)物的主要碎片離子分別為m/z192.15,m/z265.16,m/z323.03,m/z336.20,m/z320.29,m/z343.17,并將這些主要碎片離子作為定量分析時監(jiān)測的產(chǎn)物離子（MRM模式）,各檢測成分的母離子和產(chǎn)物離子見表2。

表2 MRM模式下各檢測成分和內(nèi)標(biāo)物的母離子和產(chǎn)物離子Tab.2 Optimized multiple reaction monitoring parameters for analytes and internal standard

分別取大鼠空白腎臟組織勻漿液及給藥后腎組織樣品100 μL,按“2.6” 項下方法操作,得到MRM色譜圖,見圖1。由圖可見,黃柏給藥后指標(biāo)性成分和內(nèi)標(biāo)物成分出峰保留時間分別為黃柏堿1.02 min、木蘭花堿1.10 min、藥根堿2.42 min、巴馬汀3.69 min、小檗堿4.15 min、尼莫地平7.05 min,各組分色譜峰之間分離良好,表明組織中內(nèi)源性物質(zhì)對所測定成分無干擾［10-11］。

圖1 黃柏中生物堿及內(nèi)標(biāo)物生物樣品質(zhì)譜TIC圖Fig.1 TIC spectrum of alkaloids and internal standard biological samples in P.chinense

2.8.2 線性關(guān)系及定量下限

2.8.2.1 線性關(guān)系考察 取大鼠空白腎臟組織勻漿液100 μL,加內(nèi)標(biāo)溶液和黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿系列溶液,分別制備成黃柏堿組織質(zhì)量濃度分別為3.74、7.48、14.96、24.93、59.88、119.76、239.51、437.03 ng/mL；木蘭花堿組織質(zhì)量濃度分別為15.85、31.70、63.40、126.80、253.60、507.20、1 014.40、2 028.80 ng/mL；藥根堿組織質(zhì)量濃度分別為15.80、31.6、63.20、126.40、252.80、505.60、1 011.20、2 022.40 ng/mL；巴馬汀組織質(zhì)量濃度分別為15.02、30.04、60.08、120.16、240.32、480.64、961.28、1 922.56 ng/mL；小檗堿組織質(zhì)量濃度分別為15.30、30.60、61.20、122.40、244.80、489.60、979.20、1 958.4 ng/mL；內(nèi)標(biāo)尼莫地平溶液質(zhì)量濃度相當(dāng)于500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品,按“2.6” 項下方法處理,記錄色譜圖；以待測物指標(biāo)性成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,待測物與內(nèi)標(biāo)物的面積比為縱坐標(biāo)（Y）,用加權(quán)（w=1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運算,求得直線回歸方程,結(jié)果表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表3。

2.8.2.2 定量下限 取大鼠空白腎臟組織勻漿液100 μL,加入對照品溶液制備成3.74 ng/mL黃柏堿、15.85 ng/mL木蘭花堿、15.80 ng/mL藥根堿、15.02 ng/mL巴馬汀、15.30 ng/mL小檗堿溶液,按“2.6” 方法操作,并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每一樣本測得濃度,考察定量下限。結(jié)果見表3。發(fā)現(xiàn)上述各濃度對照品的準(zhǔn)確度偏差在±20% 以內(nèi),精密度RSD≤15%［12］。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.8.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗 取空白腎組織勻漿樣品100 μL,按“2.8.2” 項下方法制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品,每一濃度平行分析6份,連續(xù)測定3 d,根據(jù)質(zhì)量控制樣品測定的結(jié)果計算本方法的準(zhǔn)確度與精密度,結(jié)果表明,樣品日內(nèi)、日間精密度RSD均小于15%,準(zhǔn)確度均在±15%的范圍之間,表明該方法準(zhǔn)確度與精密度良好。

2.8.4 提取回收率和和基質(zhì)效應(yīng)

2.8.4.1 提取回收率 取空白腎組織勻漿液100 μL,按 “2.8.3” 項下方法操作,制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品,每個濃度平行測定6份,記錄色譜峰,測定各組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積記為A。同時另取空白腎組織勻漿液100 μL,除不加內(nèi)標(biāo)物溶液外,其余按“2.6” 項下方法操作所得殘渣加入各組分對照品溶液和內(nèi)標(biāo)物溶液,并在35 ℃氮氣流吹干后,再用乙腈-水（1 ∶1）溶液復(fù)溶,渦旋充分混合,離心后取上清液進(jìn)樣分析,每個濃度平行制備6份,記錄色譜圖。測量各組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積記為B。以前種處理方法所得的峰面積A與后種處理方法獲得的峰面積B均值分別計算藥物的和內(nèi)標(biāo)物的提取回收率。結(jié)果見表4。

2.8.4.2 基質(zhì)效應(yīng) 取各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物溶液,置于EP管中,35 ℃下氮氣流吹干后用乙腈-水（1 ∶1）溶液溶解殘渣,渦旋混合,離心后取上清液進(jìn)樣分析,每個濃度3個樣本,記錄色譜圖,測定各組分色譜峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積為C。以“2.8.4.1” 項下所得峰面積B,與峰面積C均值的比值分別計算各組分和內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表4。結(jié)果表明各組分和內(nèi)標(biāo)物不存在明顯的離子抑制或離子增強(qiáng)現(xiàn)象［13］。

2.8.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.8.3” 項下方法制備各組分的低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制溶液,每一濃度平行3份。按“2.6” 項下方法,經(jīng)過室溫6 h,-80 ℃保存14 d,3個凍融循環(huán)后測定其濃度,實驗結(jié)果表明,所測的各組分在大鼠腎組織樣品中穩(wěn)定性均在±15%范圍之間,表明本實驗的生物樣品相對穩(wěn)定。

3 結(jié)果

大鼠灌胃給予生黃柏和鹽黃柏水煎液后,在不同時刻摘取大鼠腎組織臟器,采用UPLC-QqQ-MS法對腎組織中的生物堿類組分的濃度進(jìn)行測定,結(jié)果見表5。

表4 各檢測組分的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）Tab.4 Extraction recovery and matrix effects and for the analytes in rats kidney tissue （n=6）

表5 大鼠給予生制黃柏后腎組織中各檢測組分質(zhì)量濃度（ng/mL，， n=6）Tab.5 Concentrations of each analytes in rats kidney tissue after oral administration of raw and processed P.chinense（ng/mL，， n=6）

表5 大鼠給予生制黃柏后腎組織中各檢測組分質(zhì)量濃度（ng/mL，， n=6）Tab.5 Concentrations of each analytes in rats kidney tissue after oral administration of raw and processed P.chinense（ng/mL，， n=6）

表5顯示,大多數(shù)生物堿成分的含有量,在大鼠灌胃給藥后,隨著時間推移,其濃度逐漸降低,而少部分生物堿如巴馬汀和小檗堿在灌胃給藥約6 h后,其濃度又有小幅升高,推測黃柏生物堿成分在大鼠體內(nèi)的吸收可能存在肝腸循環(huán)［14-17］。此外,同一檢測組分,在同一給藥時間后,鹽黃柏相對于生黃柏在大鼠腎組織臟器中的生物堿含藥濃度較高,表明鹽炙后各組分有增強(qiáng)趨向腎組織作用效果。

4 討論

黃柏作為鹽炙品種的代表中藥之一,其經(jīng)過鹽炙之后可以引藥下行入腎,增強(qiáng)了滋腎陰、瀉腎火、退虛熱的作用。結(jié)果表明,黃柏中的生物堿類成分黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀以及小檗堿類,在黃柏鹽炙之后,同一給藥時間后,其大多數(shù)都是鹽炙品中的生物堿濃度高于生品中的生物堿,從而表明黃柏經(jīng)過鹽炙之后,生物堿類成分更加趨向于腎組織臟器的分布,進(jìn)而治療腎臟相關(guān)的疾病。前期實驗,課題組復(fù)制了腎陰虛的大鼠模型,考察不同黃柏炮制品對于腎陰虛大鼠的治療效果,并通過實驗結(jié)果可以看出黃柏經(jīng)過鹽炙之后有更好的滋腎陰、瀉腎火的作用［9］。本實驗將前期的藥效學(xué)進(jìn)行機(jī)理上的驗證,即為黃柏經(jīng)過鹽炙之后,可以增強(qiáng)其有效成分在腎組織的吸收。

本實驗通過給予大鼠不同炮制品的黃柏水煎液,考察其中生物堿類成分在腎組織臟器的藥物濃度情況,發(fā)現(xiàn)鹽炙品濃度高于生品,從腎組織吸收率的角度驗證了黃柏“鹽炙入腎” 的理論。而黃柏如何經(jīng)過鹽炙后,使其生物堿類成分在腎組織吸收效率提高,還需要從黃柏有效成分與腎組織的靶標(biāo)酶以及生物堿類成分與腎小管上皮細(xì)胞的透過率進(jìn)一步深入研究。