倪天宇，羅曉朦，張春椿，俞 冰，張水利，范慧艷

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053）

多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua為百合科黃精屬植物,是一種重要的野生中藥資源,與滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.一同收錄于2015年版《中國藥典》 一部［1］,為我國傳統(tǒng)大宗藥食同源的中藥材。多花黃精主產(chǎn)于湖南、貴州、安徽、浙江、福建等省,生林下、灌叢或山坡陰處［2］,其味甘,平,歸脾、肺、腎經(jīng),具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃精具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、改善記憶障礙、保護(hù)腎功能等多種藥理作用［3-7］。近年來,由于市場對黃精需求量的增加,引發(fā)藥農(nóng)掠奪性地采挖,導(dǎo)致野生多花黃精資源量驟減,已經(jīng)不能滿足市場需求。目前,許多學(xué)者對多花黃精的林下栽培技術(shù)模式進(jìn)行研究,主要為毛竹林、杉木林及不同郁閉度坡向坡位對多花黃精生長量的影響［8-11］,但尚未見不同生境下多花黃精主要化學(xué)成分比較的報道。因此,本實驗探討了不同野生與人工種植生境下多花黃精折干率、浸出物、黃精多糖、總黃酮、總皂苷、總酚的變化規(guī)律,探索種植生境與藥材產(chǎn)量、品質(zhì)間的關(guān)系,以期為多花黃精規(guī)范種植提供理論依據(jù)。

1 材料

中藥粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）；MS105DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DHG-2150B電熱鼓風(fēng)干燥箱（鄭州生元儀器有限公司）；G-060S超聲波清洗機(jī)（深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司）；RE52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HH420電熱恒溫水浴槽（上虞道墟茂祥儀器設(shè)備廠）；752N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

無水葡萄糖對照品（批號20141211,上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁 （批號100080-200707）、人參皂苷Rb1（批號110704-200420）、沒食子酸對照品（批號110831-201204）,均購于中國食品藥品檢定研究院；福林酚（上海源葉生物科技有限公司）；蒽酮（上海展云化工有限公司）；硫酸 （西隴科學(xué)股份有限公司）；高氯酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁（上海振欣試劑廠）；氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸、香草醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）等均為分析純。

35批樣品于2017年10至11月從浙江金華、麗水采集,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞冰副教授鑒定為百合科植物多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua的根莖,生長年限均為3年,樣品信息見表1。其中針闊混交林、毛竹林、常綠闊葉林3種生境下的樣品均為野外采收（無人工干預(yù)的野生環(huán)境）,大田及錐栗林為人工種植。

2 方法

2.1 折干率、浸出物及黃精多糖含有量測定 樣品采收后除去須根、洗凈,晾干表面水分后切成薄片,準(zhǔn)確稱定其鮮重,置于烘箱中105 ℃殺青30 min,60 ℃烘干至恒定質(zhì)量,取出,降至室溫后稱定質(zhì)量,計算折干率。

黃精多糖和浸出物含有量的測定參照2015年版《中國藥典》 一部［1］和四部［12］中的方法,各組重復(fù)測定3次。以無水葡萄糖對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,吸光度為縱坐標(biāo)（Y）,進(jìn)行回歸,得回歸方程為Y=39.252X+0.026 7 （r=0.999 5）,在0.003 4～0.020 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗RSD分別為1.09%、1.74%、1.92%；平均加樣回收率99.81%,RSD 0.98% （n=9）。

2.2 總黃酮含有量測定

2.2.1 方法學(xué)考察 精密稱取蘆丁對照品40 mg,用50%乙醇超聲溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中并定容,充分搖勻,備用。分別吸取蘆丁對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL量瓶中,然后加入0.3 mL 5%NaNO2,搖勻,靜置6 min,再加入0.3 mL 10%Al （NO3）3,搖勻,靜置6 min,最后加入2 mL 4%NaOH,以50%乙醇定容,靜置15 min,以空白試劑作對照,在510 nm處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,吸光度為縱坐標(biāo)（Y）,得回歸方程為Y=9.530 2X-0.013 9 （r=0.999 8）,在0.004 1～0.041 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗RSD分別為1.10%、1.96%、1.56%；加樣回收率 99.40%,RSD 1.45%（n=9）。

2.2.2 樣品總黃酮含有量測定 精密稱取多花黃精粉末1.5 g,平行3份,分別置于20 mL具塞試管中,加入15 mL 50% 的乙醇溶液（加入1% 鹽酸）,超聲（360 W,40 kHz）提取1 h,濾過,濾液用50%乙醇定容至25 mL。精密吸取0.3 mL,按“2.2.1” 項下方法測定和計算多花黃精總黃酮的含有量［13］。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.3 總皂苷含有量測定

2.3.1 方法學(xué)考察 精密稱取人參皂苷Rb1對照品10 mg,置10 mL量瓶中,加無水甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,備用。分別量取人參皂苷Rb1對照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL,置于具塞刻度試管中,揮盡溶液,加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液（現(xiàn)配）及0.8 mL高氯酸,搖勻,置于60 ℃水浴加熱15 min后,冰浴2 min,再加入5 mL冰醋酸,搖勻,靜置5 min。以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可分光光度法,在568 nm波長處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,吸光度為縱坐標(biāo)（Y）,進(jìn)行回歸,得回歸方程為Y=16.507X+0.024 6 （r=0.999 0）,在0.009 6～0.067 2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗RSD分別為1.34%、1.97%、1.99%；加樣回收率98.01%,RSD 1.70% （n=9）。

2.3.2 樣品總皂苷含有量測定 精密稱取多花黃精粉末1.0 g,平行3份,分別加入80% 乙醇15 mL,60 ℃超聲提取50 min,重復(fù)提取2次,合并濾液至50 mL量瓶中,加入80% 乙醇定容。精密吸取0.1 mL,按“2.3.1” 項下方法測定和計算多花黃精總皂苷含有量［14］。

2.4 總酚含有量測定

2.4.1 方法學(xué)考察 精密稱取沒食子酸對照品13 mg,置于50 mL量瓶中,加入20 mL 70%乙醇,超聲使其充分溶解,用70%乙醇定容,搖勻備用。分別取沒食子酸對照品溶液20、40、60、80、100、120 μL置于5 mL量瓶中,依次加入3.2 mL蒸餾水,福林酚顯色劑200 μL,充分振蕩后靜置6～8 min,加入15% Na2CO3溶液500 μL,搖勻,在室溫下避光放置反應(yīng)2 h,在765 nm波長處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,吸光度為縱坐標(biāo)（Y）,進(jìn)行回歸,得回歸方程為Y=77.945X+0.022 7 （r=0.999 2）,在0.001 1～0.006 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗RSD分別為0.99%、1.99%、1.87%；加樣回收率 100.51%,RSD 1.77% （n=9）。

2.4.2 樣品總酚含有量測定 精確稱取多花黃精粉末1.0 g,平行3份,分別置于試管中,加入10 mL 70% 乙醇,超聲 （360 W,40 kHz）提取30 min,濾過,取濾液,反復(fù)提取3次。合并濾液旋干,并用70% 乙醇定容至50 mL。精密吸取100 μL,按“2.4.1” 項下方法測定和計算多花黃精總酚含有量［13］。

2.5 統(tǒng)計分析 采用Excel 2010和SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對所測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析；采用單因素方差分析比較不同生境下多花黃精的折干率、浸出物、多糖、黃酮、皂苷、總酚含有量的差異；利用相關(guān)性分析分析各檢測指標(biāo)之間的相關(guān)性；采用主成分分析評價各生境下多花黃精品質(zhì)的優(yōu)劣。

3 結(jié)果

3.1 折干率比較 折干率是指藥材干燥前后質(zhì)量之比,是衡量藥材產(chǎn)率的重要指標(biāo),折干率越大,藥材得率越高。由表2可知,針闊混交林生境下多花黃精折干率與毛竹林、常綠闊葉林、錐栗林生境均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）,毛竹林與大田、常綠闊葉林生境差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,人工種植的大田與錐栗林模式樣品折干率亦存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。折干率均值由大到小依次為毛竹林、錐栗林、常綠闊葉林、大田、針闊混交林。

3.2 浸出物比較 不同生境下多花黃精醇溶性浸出物測定結(jié)果見表2,錐栗林生境下醇溶性浸出物最高,針闊混交林生境下醇溶性浸出物最低,分別為72.93%、63.40%,各生境下浸出物含有量均高于2015年版《中國藥典》 規(guī)定的不得少于45%的標(biāo)準(zhǔn)［1］。方差分析結(jié)果表明,人工種植下的錐栗林生境中樣品的浸出物含有量與針闊混交林、毛竹林、大田生境均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。浸出物均值由大到小依次為錐栗林、常綠闊葉林、毛竹林、大田、針闊混交林。

3.3 黃精多糖比較 黃精多糖是黃精的一種重要活性成分,其含有量被2015年版《中國藥典》 列為多花黃精的質(zhì)量考察指標(biāo),根據(jù)藥典要求,黃精多糖含有量≥7%為符合標(biāo)準(zhǔn)［1］。由表2可知,不同生境下黃精多糖含有量在5.35%～7.18%范圍之間,僅錐栗林生境下的樣品達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)單因素方差分析,針闊混交林生境下黃精多糖含有量與毛竹林、錐栗林均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。各生境黃精多糖均值由大到小依次為錐栗林、毛竹林、常綠闊葉林、大田、針闊混交林。

3.4 總黃酮比較 多花黃精含有天然高異黃酮類化合物［15］,由表2可知,不同生境下多花黃精總黃酮含有量在9.37～12.53 mg/g之間。其中,大田生境下最高,針闊混交林生境下最低,大田比針闊混交林、毛竹林、常綠闊葉林、錐栗林分別高出3.16、2.85、2.09、2.11 mg/g。方差分析可知,不同生境類型下多花黃精總黃酮含有量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各生境下樣品總黃酮均值由大到小依次為大田、常綠闊葉林、錐栗林、毛竹林、針闊混交林。

3.5 總皂苷比較 各生境下多花黃精總皂苷含有量測定結(jié)果見表2,其總皂苷含有量在25.78～84.98 mg/g范圍之間。方差分析結(jié)果表明,錐栗林生境下總皂苷含有量高于其余4種生境（P＜0.05）,為84.98 mg/g；毛竹林、常綠闊葉林生境總皂苷含有量均高于大田模式（P＜0.05）,分別為51.96、52.84 mg/g；大田和針闊混交林生境無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）,分別為25.78、38.28 mg/g。各生境下樣品總皂苷均值由大到小依次為錐栗林、常綠闊葉林、毛竹林、針闊混交林、大田。

3.6 總酚比較 由表2可知,不同生境下多花黃精總酚含有量在0.56～1.67 mg/g之間。其中,毛竹林生境下最高,常綠闊葉林生境下最低,毛竹林比針闊混交林、常綠闊葉林、大田、錐栗林分別高出0.55、1.11、0.70、0.47 mg/g。經(jīng)單因素方差分析,不同生境類型下多花黃精總酚含有量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。各生境下樣品總酚均值由大到小依次為毛竹林、錐栗林、針闊混交林、大田、常綠闊葉林。

表2 不同生境下多花黃精化學(xué)成分含有量比較Tab.2 Content comparison of chemical constituents of P.cyrtonemain different growing areas

3.7 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析見表3。各檢測指標(biāo)之間相關(guān)性顯著,不互相獨(dú)立。多花黃精折干率與總皂苷呈正相關(guān)（P＜0.01）,浸出物與總皂苷呈正相關(guān)（P＜0.05）。相關(guān)性分析表明,折干率與主要化學(xué)成分含有量均呈正相關(guān),這與陳怡等［16］報道一致,折干率可以從側(cè)面反映各部分水分和干物質(zhì)儲存狀況,折干率較大,表明生長代謝活躍。

表3 多花黃精各評價指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of chemical constituents in P.cyrtonema

3.8 主成分分析 為比較不同生境下多花黃精品質(zhì)的優(yōu)劣,采用SPSS 25.0軟件對所測指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。由表4可知,當(dāng)主成分個數(shù)達(dá)到3時,主成分累計貢獻(xiàn)率為72.426%,其中第1主成分貢獻(xiàn)率最大,達(dá)35.498%。用3個主成分對不同生境下的多花黃精進(jìn)行綜合評價,其綜合評價函數(shù)為F=0.490F1+0.276F2+0.234F3,可知,F1對綜合評分的影響最大,其中多花黃精的折干率、浸出物、黃精多糖和總皂苷在第1主成分上有較高載荷,見表5,表明上述4個指標(biāo)對于多花黃精的品質(zhì)影響較大。通過上述綜合評價函數(shù)計算各生境下樣品的綜合得分,結(jié)果見表6。各生境下多花黃精綜合得分由大到小依次為錐栗林、毛竹林、常綠闊葉林、大田、針闊混交林。

4 討論

生境類型是影響多花黃精生長和次生代謝物累積的因子之一［17］。本研究發(fā)現(xiàn),不同生境下多花黃精的折干率、浸出物含有量、黃精多糖以及總皂苷含有量的差異較大。2種人工種植模式中,錐栗林生境下多花黃精的品質(zhì)優(yōu)于大田生境。由于多花黃精生長期喜陰濕潤涼,不耐高溫［18］,適當(dāng)遮蔭可促進(jìn)其生長,但過度遮蔭反而會抑制其根莖生長［19］。錐栗林生境較大田而言,增加了錐栗的遮蔭,為林下種植的多花黃精構(gòu)造出相對陰濕的環(huán)境,更適宜其生長,因此,錐栗林生境下產(chǎn)出的多花黃精品質(zhì)更優(yōu)。黃精多糖及浸出物含有量被2015年版《中國藥典》 列為黃精藥材的質(zhì)量考察指標(biāo),根據(jù)藥典要求,黃精多糖含有量≥7%,浸出物≥45%為符合標(biāo)準(zhǔn)［1］,因此僅錐栗林生境下的多花黃精達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn),其余樣品均低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表4 主成分分析特征值Tab.4 Eigenvalues of principal component analysis

表5 各成分主成分特征向量Tab.5 Eigenvectors of the principal components of various constituents

表6 不同生境下多花黃精綜合得分與排名Tab.6 Comprehensive score and ranking of P.cyrtonemafrom different growing areas

3種野生生境中,毛竹林生境下多花黃精的品質(zhì)最優(yōu),常綠闊葉林生境次之,針闊混交林排名最末。3種野生生境的物種組成、林分結(jié)構(gòu)、多樣性等均存在差異,這些因素均可對多花黃精的品質(zhì)產(chǎn)生影響。常綠闊葉林和針闊混交林群落物種組成豐富、多樣性指數(shù)高,林分生物量、掉落物均顯著高于毛竹林［20］。因此在沒有人工干預(yù)的情況下,可能形成了過度遮蔭的效果,影響了多花黃精次生代謝產(chǎn)物的積累,同時豐富的群落物種也極易與多花黃精形成群落內(nèi)的種間競爭。而毛竹林是上述生境中,結(jié)構(gòu)最簡單、林中物種組成最少、多樣性最差的群落類型［20］,種間競爭壓力小,且其遮蔭度可能正好適合多花黃精的生長,結(jié)果導(dǎo)致毛竹林生境下多花黃精品質(zhì)要優(yōu)于常綠闊葉林和針闊混交林。

人工種植的錐栗林下多花黃精的品質(zhì)優(yōu)于野生的毛竹林,錐栗與多花黃精的林下復(fù)合種植,為多花黃精構(gòu)造出相對陰濕的環(huán)境,且通過人工措施干預(yù),調(diào)控了林分的郁閉度和群落的物種量,適度遮蔭的同時,減少了野外環(huán)境中存在的群落內(nèi)種間競爭,保證了錐栗林生境下多花黃精藥材的品質(zhì)。錐栗林生境下多花黃精的浸出物、黃精多糖以及總皂苷含有量均為最高,折干率和總酚僅次于毛竹林生境,總黃酮含有量位列第三,通過主成分分析可知,5種不同類型生境中,以錐栗林生境下種植的多花黃精品質(zhì)最佳。多花黃精在錐栗林下的種植模式屬于典型的林藥間作模式,它將適宜在林下生長、具有一定耐蔭性的藥用植物引種到林下進(jìn)行栽培,不僅種植的多花黃精品質(zhì)優(yōu)異,還可充分利用土地資源,獲得更高的社會經(jīng)濟(jì)利益和生態(tài)效益［21］,錐栗與多花黃精的林下復(fù)合種植模式值得推廣。