姜 兵，吳若銘，張 聰，鐘孝正，洪 毅，沈曉燕*

（1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理系，上海 201203；2.上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院，上海 201203；3.上海醫(yī)藥集團青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，山東青島 266510）

抑郁癥是一種異質(zhì)性疾病,導(dǎo)致這種疾病的確切神經(jīng)機制尚未被發(fā)現(xiàn)。抑郁癥是一個日益嚴(yán)重的全球性問題,并一直與冠心?。╟oronary heart disease,CHD）的風(fēng)險增加有關(guān)［1-2］。抑郁癥與增加CHD風(fēng)險的確切機制是復(fù)雜的、多因素的,目前還不完全清楚。CHD患者的抑郁癥發(fā)病率是普通人群的2～3倍,約為15%～30%,女性約為男性的2倍,急性心肌梗死 （myocardial infarction,MI）后的年輕女性尤其受影響［3-4］。抑郁癥是冠心病的一個危險因素,其特征是從輕微的抑郁癥狀到臨床診斷的嚴(yán)重抑郁癥,抑郁癥和冠心病發(fā)病率的流行病學(xué)研究顯示較高水平的抑郁癥狀與較高的風(fēng)險相關(guān)［2］。

養(yǎng)心氏片由13種中草藥（黃芪、黨參、丹參、葛根、淫羊藿、山楂、地黃、當(dāng)歸、黃連、醋延胡索、靈芝、人參、炙甘草）組成,功效為益氣活血、化瘀止痛。適于氣虛血瘀所致的胸痹,癥見心悸氣短、胸悶、心前區(qū)刺痛,廣泛用于臨床治療冠心病。臨床研究表明,養(yǎng)心氏片可以促進經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后的康復(fù),并降低心血管事件的發(fā)生率［5］。根據(jù)臨床觀察,養(yǎng)心氏片能夠改善冠心病合并抑郁狀態(tài)［6］。多項Meta分析結(jié)果表明,養(yǎng)心氏片在治療冠心病心絞痛、心律失常以及慢性心力衰竭上具有較高安全性［7］,并且能提高常規(guī)西藥治療的療效［8］。本研究對養(yǎng)心氏片治療心肌梗死后合并抑郁癥大鼠的藥效進行觀察,并探討相關(guān)機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 養(yǎng)心氏片（0.6 g/片,批號150505）購自上海醫(yī)藥集團青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司；鹽酸氟西汀片購自常州四藥制藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自江西科倫藥業(yè)有限公司；水合氯醛、羧甲基纖維素鈉購自國藥集團；TRIzol、RT Reagents、SYBR mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DEPC購自碧云天生物技術(shù)研究所；TNF-α 試劑盒、IL-1β 試劑盒、IL-6試劑盒購自上海達科為生物技術(shù)有限公司；5-HT試劑盒、CORT試劑盒、ACTH試劑盒、NE試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器 基因擴增儀購自美國BIO-RAD公司；超微量分光光度計購自中國上海寶予德有限公司；酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan Systems Inc公司；心電監(jiān)護儀SMUP-PC購自中國上海嘉龍教儀廠；小動物呼吸機購自中國北京中西化玻儀器有限公司；小動物超聲機Vevo 2100 lmaging System購自加拿大Visual Sonics公司。

1.3 動物 50只SD雄性大鼠（180～220 g）購自上海斯萊克實驗動物有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬）2012-0002。大鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)SPF級別動物房中,可以自由食用無菌食物和水。所有動物操作程序均符合中國動物福利法和復(fù)旦大學(xué)實驗動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定。動物倫理批準(zhǔn)號2018-10-YL-SXY-01。

2 方法

2.1 分組 50只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組（等體積0.5% CMC-Na）、氟西汀組（10 mg/kg）、養(yǎng)心氏片低劑量和高劑量組（500、1 000 mg/kg）,每組10只,灌胃給藥4周,1次/d。將大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中,正常提供食物和水,保證12 h光照周期。

2.2 造模及給藥 使用10% 水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。將大鼠置于手術(shù)臺上固定,連接心電圖監(jiān)護系統(tǒng),并記錄術(shù)前心電圖,大鼠胸前左側(cè)至腋窩處手術(shù)備皮,仰臥位固定于手術(shù)臺上,75%酒精消毒手術(shù)視野。經(jīng)氣管切開插管,以專用小動物呼吸機行正壓人工呼吸,打開胸腔暴露心臟,輕輕將心臟包膜分離用醫(yī)用棉棒挑起左心耳,暴露左心耳與肺動脈圓錐之間的結(jié)扎區(qū)域。用6～0的醫(yī)用縫合針線在離左心耳與肺動脈圓錐交接處2 mm左右永久性結(jié)扎左冠狀動脈前降支。觀察心電圖變化,顯示ST段抬高≥0.15 mV,并且心臟出現(xiàn)因缺血而致的顏色改變,結(jié)扎成功,用醫(yī)用棉球和棉棒清除胸腔內(nèi)積血。觀察呼吸情況良好,對好肋間肌肉和肋骨,縫合胸腔,假手術(shù)組僅穿過左冠狀動脈前降支而不結(jié)扎,其余操作與梗死組動物相同,手術(shù)后將大鼠單籠飼養(yǎng)。造模成功后進行強迫游泳誘發(fā)抑郁癥［9］。大鼠心外膜顏色的改變證實了心臟缺血。完成手術(shù)造模的第2天,評估心梗以確認(rèn)心肌梗死造模成功。通過行為學(xué)實驗來評價大鼠抑郁程度,包括糖水消耗、游泳不動時間以及曠場運動評估抑郁癥狀造模成功。大鼠在胸部和皮膚閉合及拔管后返回籠中恢復(fù)7 d后,進行強迫游泳誘發(fā)抑郁癥,游泳結(jié)束后的第2天進行行為學(xué)評價。大鼠在確認(rèn)心梗模型造模成功后,開始給藥,大鼠心肌梗死后抑郁模型的造模周期為10 d。在進行造模前,假手術(shù)組、模型組、氟西汀組、養(yǎng)心氏片低劑量和高劑量組,每組分別為12只大鼠,心梗造模過程中,假手術(shù)組、模型組分和氟西汀組別各死亡1只大鼠,養(yǎng)心氏高劑量組死亡2只大鼠；在抑郁造模過程中,模型組和養(yǎng)心氏低劑量組各死亡1只大鼠。最終每組選擇10只大鼠進行后續(xù)的實驗以及數(shù)據(jù)分析。

2.3 心臟彩超檢測 造模成功后,每組中的10只大鼠進行超聲心動圖檢測,利用小動物超聲機記錄左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室舒張期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮期內(nèi)徑 （LVIDs）等,并計算左室射血分?jǐn)?shù)（EF%）和左室短軸縮短率（FS%）。

2.4 蔗糖水偏好測試 實驗前在安靜的房間內(nèi),訓(xùn)練動物適應(yīng)含糖飲水,每籠同時放置2個水瓶,第一個24 h內(nèi),2瓶均盛1% 蔗糖水,隨后的24 h,一個瓶盛1%蔗糖水,另一個瓶盛純水。禁食禁水24 h后,每只大鼠給予事先定量好的2瓶水：一瓶1%蔗糖水,一瓶純水,1 h后,取2瓶水稱量。計算大鼠的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗。糖水偏愛=（糖水消耗/總液體消耗）×100%。

2.5 強迫游泳實驗 將大鼠單個放入水深為25 cm的塑料圓筒中 （高45 cm,直徑30 cm）,水溫25 ℃,時間共6 min,前2 min作為大鼠適應(yīng)階段,后4 min納入不動狀態(tài)的時間統(tǒng)計。

2.6 曠場實驗 根據(jù)大鼠穿越底面方格塊數(shù)作為水平活動得分,以直立次數(shù)作為垂直活動得分,水平和垂直活動得分總和為總評分。敞箱裝置為長寬各100 cm （底面被等分為25個等邊方格）、高50 cm各面漆黑的箱子。將大鼠放入中心格內(nèi),觀察大鼠在3 min內(nèi)穿越格數(shù)（四爪均進入的方格才記數(shù),為水平運動得分）、后肢直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運動得分）。

2.7 血清中生物標(biāo)志物的測定 按照相應(yīng)的ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α （腫瘤壞死因子-α）、IL-1β （白細(xì)胞介素-1β）、IL-6 （白細(xì)胞介素-6）、5-HT （5-羥色胺）、CORT （血清皮質(zhì)酮）、ACTH （釋放促腎上腺皮質(zhì)激素）、NE（去甲腎上腺素）水平。

2.8 RT-PCR檢測 稱取海馬適量置于1.5 mL離心管中,加入TRIzol 1 mL室溫靜置5 min后,加入200 μL氯仿,劇烈震蕩15 s后靜置2 min,4 ℃、12 000 g離心15 min,吸取上清置于新的1.5 mL離心管中,加入異丙醇500 μL,室溫放置10 min,4 ℃、12 000 g離心10 min,加入1 mL 75%乙醇,4 ℃、7 500 g離心5 min,棄上清,晾干后加入20 μL DEPC水溶解。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入正反向引物進行擴增。引物由上海生工工程有限公司合成,序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

3 結(jié)果

3.1 養(yǎng)心氏片改善心肌梗死后抑郁大鼠的心臟功能 表2、圖1顯示,與假手術(shù)組比較,模型組中的大鼠心功能嚴(yán)重受損,主要表現(xiàn)為LVIDd、LVIDs和LVEDV、LVESV增大（P＜0.01）,FS和EF減小（P＜0.01）；與模型組比較,養(yǎng)心氏片能夠改善心臟功能（P＜0.05,P＜0.01）。

3.2 養(yǎng)心氏片緩解心肌梗死后大鼠的抑郁癥 表3～5顯示,與假手術(shù)組比較,模型組中的大鼠不論是對于糖水的偏好（P＜0.01）,強迫游泳中運動時間（P＜0.01）,曠場實驗中運動得分（P＜0.05）都下降。與模型組比較,氟西汀組大鼠的以上指標(biāo)均有改善（P＜0.05,P＜0.01）,顯示建模成功。與模型組比較,養(yǎng)心氏片組中大鼠的糖水偏好（P＜0.05）,曠場實驗中運動得分（P＜0.05）上升；強迫游泳中的不動時間下降（P＜0.01）,顯示養(yǎng)心氏片能夠有效緩解大鼠心肌梗死后的抑郁癥狀。

表2 超聲心動圖的血流動力學(xué)參數(shù)比較（， n=10）Tab.2 Comparison of hemodynamic parameters of echocardiography in rats of each group （， n=10）

表2 超聲心動圖的血流動力學(xué)參數(shù)比較（， n=10）Tab.2 Comparison of hemodynamic parameters of echocardiography in rats of each group （， n=10）

注：與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

圖1 各組大鼠心臟彩超圖Fig.1 Cardiac color Doppler ultrasonography of rats in each group

表3 各組大鼠糖水消耗比較（， n=10）Tab.3 Comparison of sucrose preference in rats of each group （， n=10）

表3 各組大鼠糖水消耗比較（， n=10）Tab.3 Comparison of sucrose preference in rats of each group （， n=10）

注：與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05。

表4 各組大鼠游泳不動時間比較（， n=10）Tab.4 Comparison of immobility time of rats in each group （， n=10）

表4 各組大鼠游泳不動時間比較（， n=10）Tab.4 Comparison of immobility time of rats in each group （， n=10）

注：與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與模型組比較,##P＜0.01。

表5 各組大鼠曠場實驗運動得分比較（， n=10）Tab.5 Comparison of open-field exercise scores of rats in each group （， n=10）

表5 各組大鼠曠場實驗運動得分比較（， n=10）Tab.5 Comparison of open-field exercise scores of rats in each group （， n=10）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.3 養(yǎng)心氏片降低心肌梗死后抑郁大鼠的炎癥水平 圖2顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中的炎癥因子TNF-α （P＜0.01）、IL-1β （P＜0.01）、IL-6 （P＜0.05）水平上升。與模型組比較,養(yǎng)心氏片高劑量組大鼠血清的TNF-α （P＜0.01）、IL-1β （P＜0.05）、IL-6 （P＜0.05）下降,表明養(yǎng)心氏片能夠有效降低心肌梗死后抑郁大鼠的炎癥水平。

3.4 養(yǎng)心氏片上調(diào)心肌梗死后抑郁大鼠的單胺神

經(jīng)遞質(zhì)水平 圖3顯示,與假手術(shù)組比較,模型組中大鼠血清中5-HT （P＜0.01）、ACTH （P＜0.01）、CORT （P＜0.01）、NE （P＜0.01）下降,與模型組比較,氟西汀組（P＜0.05）與養(yǎng)心氏片高劑量組（P＜0.05,P＜0.01）大鼠的上述血清標(biāo)志物升高。

3.5 養(yǎng)心氏片降低模型大鼠海馬區(qū)的炎癥水平及

圖2 養(yǎng)心氏片對大鼠血清炎癥因子水平的影響Fig.2 Effects of Yangxinshi Tablets on serum inflammatory factors levels in rats

圖3 養(yǎng)心氏片對大鼠血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響Fig.3 Effects of Yangxinshi Tablets on serum monoamine neurotransmitters levels in rats

抑制犬尿酸通路限速酶的表達 圖4～5顯示,與假手術(shù)組比較,模型組中大鼠TNF-α（P＜0.01）及IL-6 （P＜0.01）mRNA表達上升。與模型組比較,養(yǎng)心氏片高劑量組大鼠TNF-α（P＜0.05）及IL-6 （P＜0.01）mRNA表達下降。對于犬尿酸通路中限速酶,養(yǎng)心氏片對IDO1、 KMO、 KYNUmRNA表達與TNF-α、IL-6呈現(xiàn)出相同的趨勢（P＜0.05）。表明養(yǎng)心氏片能夠有效降低心肌梗死后抑郁大鼠海馬區(qū)的炎癥水平并抑制犬尿酸通路中限速酶的表達。

4 討論

在冠心病患者中,抑郁與功能損害的嚴(yán)重程度、治療的依從性和心臟康復(fù)的參與度降低有關(guān)。多項薈萃分析為臨床抑郁癥（狀）與冠心病之間的關(guān)聯(lián)提供了證據(jù)［10-11］。盡管研究結(jié)果存在一些異質(zhì)性,但大部分證據(jù)支持這樣一種觀點,即急性冠脈綜合征（acute coronary syndromes,ACS）后抑郁是全因和心臟死亡率的危險因素,以及包括死亡率或非致命性心臟事件在內(nèi)的復(fù)合終點［3］。中國的一項前瞻性隊列研究,對633例非阻塞性冠狀動脈（MINOCA）患者進行3年隨訪,顯示抑郁與全因死亡率和心血管事件的顯著相關(guān)性［12］。在冠心病患者中,抑郁癥狀是生活質(zhì)量（QoL）的最強預(yù)測因子［13］。抑郁癥不僅獨立于CHD的嚴(yán)重程度與日常生活心絞痛相關(guān),而且相較于冠狀動脈疾病或其他傳統(tǒng)風(fēng)險指標(biāo)更能預(yù)測心絞痛的嚴(yán)重程度［14］。本研究的實驗結(jié)果顯示,養(yǎng)心氏片能夠有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心臟功能,同時明顯緩解抑郁癥狀。

圖4 養(yǎng)心氏片對大鼠海馬區(qū)炎癥因子的影響Fig.4 Effects of Yangxinshi Tablets on inflammatory factor in hippocampus of rats

圖5 養(yǎng)心氏片對大鼠海馬區(qū)犬尿酸通路限速酶表達的影響Fig.5 Effects of Yangxinshi Tablets on the expression of rate-limiting enzyme in kynurenine pathway in rat hippocampus

抑郁癥和較差的冠心病預(yù)后之間的潛在機制是復(fù)雜的,多因素的?？挂钟羲幾饔糜诖竽X中的5-羥色胺,多巴胺和去甲腎上腺素系統(tǒng)以及其他神經(jīng)遞質(zhì)回路,包括選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑,三環(huán)抗抑郁藥,5-羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑以及其他作用機制的抗抑郁藥。但是,這些藥物同樣引起心血管不良反應(yīng),如QT間期的延長、低血壓、心律失常和出血風(fēng)險增加等［15］。

一個與抑郁癥相關(guān)的冠心病風(fēng)險增加的假設(shè)機制是慢性炎癥,這是動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)展的已知風(fēng)險因素［16］。作為心血管疾?。╟ardiovascular diseases,CVD）結(jié)果的預(yù)測因子,IDO1的過度表達伴隨著色氨酸（tryptophan,TRP）分解代謝的增加被證明可由慢性系統(tǒng)性低度炎癥（chronic systemic low-grade inflammation,CSLGI）引起［17］。作為控制Trp分解代謝速率的限速酶,IDO1可被干擾素和白細(xì)胞介素等促炎細(xì)胞因子激活［18］。抑郁癥與持續(xù)的炎癥狀態(tài)和增加的炎癥因子濃度有關(guān),如TNF-α、IL-1β 和IL-6,對心臟和循環(huán)有已知的不良影響［19］。在臨床上,炎癥被認(rèn)為是抑郁患者的潛在病因和治療目標(biāo)［19］。本實驗證實養(yǎng)心氏片能夠有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能和抑郁癥狀,同時顯著降低大鼠血清中炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和海馬區(qū)的炎癥（TNF-α、IL-6）水平。

由于犬尿氨酸（kynurenin,KYN）途徑的代謝分流導(dǎo)致可用于血清素（5-HT）合成的TRP的減少被認(rèn)為是抑郁癥可能的病理生理機制［20］。研究證實抑郁癥中存在促炎狀態(tài),IDO1參與KYN介導(dǎo)的代謝分流,加速TRP的消耗并且促進TRP代謝為KYN［21］。一項廣泛的隊列研究顯示IDO1活性與動脈粥樣硬化初始階段和頸動脈中膜厚度增加呈正相關(guān)［22］。人體內(nèi)的KYN及其代謝產(chǎn)物3-羥基犬尿氨酸 （3-hydroxykynurenine,3HK）、喹啉酸（quinolinic acid,QUIN）和犬尿喹啉酸（kynurenic acid,KYNA）的水平與抑郁癥密切相關(guān)［23］。這些化合物具有導(dǎo)致抑郁的作用,包括調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞死亡,谷氨酸轉(zhuǎn)移和神經(jīng)炎癥［24］。在促炎條件下,KYN與神經(jīng)炎癥有關(guān),并被認(rèn)為有助于抑郁癥的發(fā)病機制［24］。與健康對照受試者比較,抑郁癥患者的血漿KYNA和KYNA/KYN比率顯著降低,且接受6周選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI）治療可顯著增加首發(fā)抑郁癥的初治患者的KYNA/KYN比率［25］。臨床實驗結(jié)果顯示,SSRI抗抑郁藥艾司西酞普（escitalopram）可通過抑制具有神經(jīng)毒性的犬尿氨酸代謝物的合成而發(fā)揮其抗抑郁作用,并且通過減少炎癥反應(yīng)來發(fā)揮其抗抑郁作用［26］。本實驗發(fā)現(xiàn),養(yǎng)心氏片能夠有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能和抑郁癥狀,并且顯著上調(diào)單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平。同時,養(yǎng)心氏片能夠有效降低大鼠海馬區(qū)中炎癥水平和抑制犬尿酸途徑中限速酶（IDO1、KMO和KYNU）的表達。

以上證據(jù)表明,炎癥增強以及相關(guān)的KYN代謝失衡可能是CVD和抑郁癥共有的病理生理機制。因此,抗炎治療、抑制KYN的代謝途徑同時增加單胺神經(jīng)遞質(zhì)的利用,為冠心病合并抑郁癥患者治療提供了可能的策略。目前的抗抑郁西藥均能夠透過血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）,直接作用于腦部。但是中藥成分復(fù)雜,多數(shù)活性成分溶解性較差。本實驗結(jié)果表明,養(yǎng)心氏片可以通過減輕炎癥反應(yīng)、抑制犬尿氨酸途徑、增加單胺神經(jīng)遞質(zhì),同時改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能以及抑郁癥狀,以期為養(yǎng)心氏片治療心血管疾病合并抑郁癥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù),也為中藥“腦病外治”“心腦同治” 提供參考。