張亞林，喻海洋，黃 濤*

（1.黃河科技學(xué)院，河南鄭州 450005；2.河南省人民醫(yī)院，河南鄭州 450011）

近年來(lái),大黃臨床應(yīng)用范圍正在逐漸擴(kuò)大［1-2］,其主要活性成分為大黃酸,具有抗炎、降血脂、降血壓、保肝、抗腫瘤等藥理活性［3-4］,研發(fā)價(jià)值較大,但該成分在37 ℃時(shí)的溶解度僅為3.89 μg/mL［5］,生物利用度也僅為16.4%［6］。

納米混懸劑是將難溶性藥物與穩(wěn)定劑通過(guò)不同制劑技術(shù)制得的一種 “純” 藥物膠態(tài)分散體系［7-9］,其載藥量大,制備工藝簡(jiǎn)單,可促進(jìn)藥物快速溶出,提高其口服吸收生物利用度,丹曲林（商品名Ryanodex,英國(guó)Norgine公司）、茶堿（商品名Theodir,日本Mitsubishi Tanabe Pharma公司）等上市產(chǎn)品均采用了該技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)制備了大黃酸納米混懸劑,并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué),以期為其他相關(guān)制劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

AR2140型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀 （美國(guó)Agilent公司）；ATS型均質(zhì)機(jī)（加拿大Seeker公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Master-sizer型粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；AP-40-110LA型超低溫冰箱（浙江愛(ài)普生儀器有限公司）；TYH-2型氮?dú)獯祾邇x（廣西大學(xué)附屬科學(xué)儀器有限公司）。

大黃酸原料藥（批號(hào)H160515,純度98.0%,陜西森弗生物技術(shù)有限公司）；大黃酸對(duì)照品（批號(hào)110757-201504,純度98.6%,中國(guó)食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（批號(hào)AL-PC-98T,輔必成上海醫(yī)藥科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na,批號(hào)A1706-32,上海長(zhǎng)光企業(yè)發(fā)展有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP K30,批號(hào)25000240379,亞什蘭集團(tuán)公司）；肝素鈉（批號(hào)20160511S,新泰市朝陽(yáng)生化研究所）。

清潔級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量（300±20）g,購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃酸含有量測(cè)定（HPLC法）

2.1.1 色譜條件 Agilent Plus C18色譜柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）；流動(dòng)相0.2% 磷酸-甲醇（35 ∶65）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取10.14 mg大黃酸對(duì)照品,溶于10 mL甲醇中,得到1.014 mg/mL貯備液,流動(dòng)相依次稀釋至507、253.5、101.4、50.7、5.07 μg/mL,作為對(duì)照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,得方程為Y=0.501 1X-5.322 1 （r=1.000 0）,在5.07～507 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 方法學(xué)考察 取1.0 mL大黃酸納米混懸液至10 mL量瓶中,甲醇超聲溶解后定容,作為供試品溶液,于4、8、12、24、48 h在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得大黃酸峰面積RSD為0.57%,表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.1.2” 項(xiàng)下5.07、253.5、507 μg/mL對(duì)照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得大黃酸日內(nèi)精密度RSD小于0.63%,日間精密度RSD小于1.03%,表明該方法精密度良好。取不含大黃酸的空白納米混懸劑適量,甲醇依次稀釋至50、100、150 μg/mL,測(cè)得大黃酸加樣回收率為99.36%～100.07%,RSD小于1.54%。

2.2 大黃酸納米混懸劑制備 取大黃酸50 mg、大豆卵磷脂25 mg,加入30 mL丙酮,45 ℃下磁力攪拌3 h至溶液澄清,減壓濃縮至約5 mL,作為有機(jī)相,冷卻至室溫；取適量PVP K30,加到50 mL蒸餾水中溶解,作為水相,在轉(zhuǎn)速1 000 r/min、一定制備溫度下將有機(jī)相緩慢滴加到水相中,45 ℃下減壓濃縮20 min以除去丙酮,在一定均質(zhì)壓力下循環(huán)均質(zhì)一定次數(shù),補(bǔ)加蒸餾水至50 mL,即得。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 PVP K30用量 固定制備溫度15 ℃,均質(zhì)壓力80 MPa,均質(zhì)次數(shù)10次,考察PVP K30用量25、50、75、100 mg對(duì)粒徑的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知,PVP K30用量為75 mg時(shí)粒徑最小。

2.3.2 制備溫度 固定PVP K30用量75 mg,均質(zhì)壓力80 MPa,均質(zhì)次數(shù)10次,考察制備溫度0、15、30、45 ℃對(duì)粒徑的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知,制備溫度為0 ℃時(shí)粒徑最小。

2.3.3 均質(zhì)壓力 固定PVP K30用量75 mg,制備溫度0 ℃,均質(zhì)次數(shù)10次,考察均質(zhì)壓力60、80、100、120 MPa對(duì)粒徑的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知,均質(zhì)壓力為100 MPa時(shí)粒徑最小。

圖1 PVP K30用量對(duì)粒徑的影響Fig.1 Effect of PVP K30 consumption on particle size

圖2 制備溫度對(duì)粒徑的影響Fig.2 Effect of preparation temperature on particle size

圖3 均質(zhì)壓力對(duì)粒徑的影響Fig.3 Effect of homogenization pressure on particle size

2.3.4 均質(zhì)次數(shù) 固定PVP K30用量75 mg,制備溫度0 ℃,均質(zhì)壓力100 MPa,考察均質(zhì)次數(shù)8、10、12、15、20次對(duì)粒徑的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知,均質(zhì)次數(shù)15次時(shí)粒徑最小。

圖4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑的影響Fig.4 Effect of homogenization frequency on particle size

2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以PVP K30用量（A）、均質(zhì)壓力（B）、均質(zhì)次數(shù)（C）為影響因素,粒徑（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo),正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝,因素水平見(jiàn)表1,結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表2可知,粒徑最小的最優(yōu)工藝為A2B2C2；由表3可知,因素C具有顯著影響（P＜0.05）,而B(niǎo)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。最終確定,大黃酸納米混懸劑制備方法為取大黃酸50 mg、大豆卵磷脂25 mg,加入30 mL丙酮,45 ℃下磁力攪拌3 h至溶液澄清,減壓濃縮至約5 mL,作為有機(jī)相,冷卻至室溫；取75 mg PVP K30,加入50 mL蒸餾水中溶解,作為水相,在轉(zhuǎn)速1 000 r/min、制備溫度0 ℃下將有機(jī)相緩慢滴加到水相中,45 ℃下減壓濃縮20 min以除去丙酮,在均質(zhì)壓力100 MPa下循環(huán)均質(zhì)15次,補(bǔ)加蒸餾水至50 mL,即得。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得平均粒徑為（170.86±3.07）nm,表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.5 大黃酸納米混懸劑表征

2.5.1 載藥量 精密量取5 mL納米混懸劑,不加凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥,稱定質(zhì)量M1,加入100 mL甲醇溶解,10 000 r/min離心15 min,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算質(zhì)量M2,平行3次,計(jì)算載藥量,公式為載藥量= M2/M1×100%。結(jié)果,載藥量為（32.14±0.92）%。

2.5.2 粒徑、Zeta電位 按優(yōu)化工藝平行制備3批大黃酸納米混懸劑,各取0.1 mL,蒸餾水稀釋50倍后測(cè)定粒徑、Zeta電位,結(jié)果見(jiàn)圖5～6。由此可知,納米混懸劑平均粒徑為（170.86±3.07）nm,Zeta電位為 （-31.90±1.34）mV,PDI為0.124±0.016。

圖5 納米粒粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoparticles

圖6 納米粒Zeta電位Fig.6 Zeta potential of nanoparticles

2.5.3 形態(tài) 取大黃酸納米混懸劑適量,稀釋50倍后滴于銅網(wǎng)上,濾紙吸去水分后自然晾干,置于透射電鏡（TEM）選定區(qū)域中拍照,結(jié)果見(jiàn)圖7。由此可知,納米混懸劑中納米粒呈球形,分布均勻,粒子之間無(wú)粘連。

圖7 納米混懸劑TEM圖Fig.7 TEM image for nanosuspensions

2.5.4 體外釋藥 取大黃酸納米混懸液4 mL,加入5%甘露醇,在-60 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍48 h后取出,迅速置于-25 ℃冷凍干燥機(jī)中處理12 h,再于6 h內(nèi)緩慢升溫至25 ℃,保持3 h后取出,即得凍干粉。取大黃酸及其納米混懸液凍干粉（以大黃酸計(jì)10 mg）適量,加入2 mL超聲脫氣水制備混懸液,轉(zhuǎn)移至活化透析袋中,兩端扎緊,設(shè)定溶出儀溫度為（37±1）℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min,溶出介質(zhì)為900 mL超聲脫氣水,于不同時(shí)間點(diǎn)各取樣3.0 mL,并保持溶出介質(zhì)體積不變,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,繪制體外釋藥曲線,見(jiàn)圖8。由此可知,納米混懸劑40 min內(nèi)累積溶出度為95.73%,但原料藥90 min內(nèi)僅為16.13%。

圖8 大黃酸體外釋藥曲線Fig.8 In vitrodrug release curves for rhein

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

2.6.1 分組、給藥及采血 12只大鼠隨機(jī)分為2組,每組6只,給藥前空腹12 h,灌胃給予大黃酸及其納米混懸劑凍干粉的0.5% CMC-Na混懸液（25.0 mg/mL）,給藥劑量均為50 mg/kg （以大黃酸計(jì)）,于0.083、0.167、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h眼眶靜脈叢取血各約0.3 mL,置于肝素化離心管中（在6 h內(nèi)補(bǔ)充適量生理鹽水以防止生理性缺血）,2 500 r/min離心2 min,置于-20 ℃冰箱中。

2.6.2 血漿樣品處理 參考文獻(xiàn)［4］報(bào)道的方法。血漿樣品在室溫下解凍后精密吸取100 μL至離心管中,加入1.5 mL甲醇渦旋5 min后12 000 r/min離心5 min,取上清液,40 ℃下緩慢吹干,100 μL甲醇復(fù)溶。

2.6.3 線性關(guān)系、專(zhuān)屬性考察 取“2.1.2” 項(xiàng)下貯備液適量,甲醇依次稀釋至12.68、6.34、3.17、1.585、0.317 μg/mL,各精密量取0.4 mL,45 ℃氮?dú)饩徛等ビ袡C(jī)溶劑后加入0.4 mL空白血漿,作為血漿對(duì)照品溶液,各精密吸取100 μL,按“2.6.2” 項(xiàng)下方法處理后在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,得方程為Y=2.523 7X-2.208 4 （r=0.991 3）,在0.317～12.68 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外,大黃酸在7.68 min時(shí)出峰,血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定,表明該方法專(zhuān)屬性良好。

2.6.4 方法學(xué)考察 取給藥后1.0 h血漿樣品,室溫下解凍后于0、2、6、12、24、48 h在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得大黃酸峰面積RSD為2.14%,表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.6.3” 項(xiàng)下12.68、6.34、0.317 μg/mL血漿對(duì)照品溶液,同一天在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得大黃酸日內(nèi)精密度RSD分別為11.38%、7.62%、8.27%；每天測(cè)定1次,連續(xù)5 d,測(cè)得大黃酸日間精密度RSD分別為10.93%、8.44%、9.63%,表明該方法精密度良好。取100 μL空白血漿,甲醇依次稀釋至12.68、6.34、1.585 μg/mL,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得大黃酸方法回收率（測(cè)得質(zhì)量濃度、初始質(zhì)量濃度的比值）為92.87%～97.14%,RSD均小于5.96%。取 “2.6.3” 項(xiàng)下12.68、6.34、1.585 μg/mL血漿對(duì)照品溶液,按“2.6.2” 項(xiàng)下方法處理后在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次；另取“2.6.3” 項(xiàng)下不加空白血漿的上述3種質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得大黃酸萃取回收率（加血漿、不加血漿對(duì)照品溶液峰面積的比值）為85.37%～91.61% 之間,RSD分別為9.91%、10.48%、8.43%。

2.6.5 分析結(jié)果 采用3P97程序統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表4,繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,見(jiàn)圖9。由此可知,納米混懸劑t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥 （P＜0.01）,tmax雖有所提前但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,相對(duì)生物利用度提高至2.02倍。

表4 大黃酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for rhein （，n=6）

表4 大黃酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for rhein （，n=6）

注：與大黃酸比較,**P＜0.01。

圖9 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.9 Plasma concentration-time curves for samples

3 討論

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)聚山梨酯80、聚乙烯醇、磷脂、泊洛沙姆188等穩(wěn)定劑進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)所制得納米混懸劑均存在粒徑稍大、PDI＞0.3、穩(wěn)定性差等問(wèn)題［10-11］。本實(shí)驗(yàn)將PVP K30與磷脂聯(lián)合應(yīng)用后,有效改善了上述問(wèn)題,其原因可能為PVP K30分子鏈具有一定延展性,可形成空間阻力而防止納米粒之間聚集［12-13］；磷脂吸附于納米粒表面時(shí)提供了電荷,可利用電荷排斥力來(lái)提高其穩(wěn)定性［14-15］。據(jù)報(bào)道,大黃酸在70 ℃下可在3 h內(nèi)保持穩(wěn)定［16］,故本實(shí)驗(yàn)的制備條件（45 ℃下磁力攪拌3 h）不會(huì)對(duì)大黃酸穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響。另外,在制備體系中加入大豆磷脂也有助于提高大黃酸的穩(wěn)定性［17］。

體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示,大黃酸納米混懸劑凍干粉tmax較大黃酸略有提前,但無(wú)顯著差異,由于兩者該參數(shù)均較快,故在0.5 h內(nèi)設(shè)置4個(gè)采血點(diǎn)；凍干粉t1/2、 Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著高于原料藥,相對(duì)生物利用度提高至2.02倍,其原因可能是納米混懸劑口服進(jìn)入機(jī)體后可增強(qiáng)藥物對(duì)腸道黏膜的黏附性,延長(zhǎng)滯留時(shí)間,間接促進(jìn)藥物吸收,同時(shí)也對(duì)其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響［18］,而且納米級(jí)藥物可在伊派爾結(jié)中大量聚集,通過(guò)淋巴結(jié)中的M細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán),從而改變了藥物吸收途徑及藥動(dòng)學(xué)［19-22］。另外,大黃酸水溶性、脂溶性均不理想［5］,而納米混懸劑可不改變?cè)摮煞种苄裕ㄍ改ば裕┑耐瑫r(shí)影響其生物利用度,能為該劑型后續(xù)研究（如藥效學(xué)等）奠定基礎(chǔ)［23-24］。