鄧永建，陸震鳴，張曉娟，柴麗娟，李 信，余永建，李華鐘，史勁松，許正宏,

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212143；4.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

按照醋酸發(fā)酵方式的差異，釀造食醋可分為固態(tài)發(fā)酵食醋、液態(tài)發(fā)酵食醋、固液復(fù)合發(fā)酵食醋等，其中固態(tài)發(fā)酵食醋以東方谷物醋為主，如我國(guó)的山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川麩醋等[1]，而液態(tài)發(fā)酵食醋廣泛存在于世界各地，如德國(guó)酒精醋、英國(guó)麥芽醋、意大利葡萄醋等。液態(tài)發(fā)酵法又可分為表面靜態(tài)發(fā)酵法、深層通風(fēng)發(fā)酵法和滴淋發(fā)酵法等[2]，其中深層通風(fēng)發(fā)酵法由于具有生產(chǎn)速度快、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用廣泛[3]。

液態(tài)發(fā)酵米醋主要以大米為原料，經(jīng)蒸煮、糖化、乙醇發(fā)酵獲得米酒，進(jìn)而接種醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵而成[4]。與傳統(tǒng)多菌種固態(tài)釀醋工藝相比，液態(tài)發(fā)酵制醋的原料和釀造菌種相對(duì)單一，發(fā)酵周期較短，產(chǎn)酸以醋酸為主，產(chǎn)品酸感刺激、風(fēng)味寡淡、口感單調(diào)。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)液態(tài)發(fā)酵食醋的研究主要集中在篩選產(chǎn)酸速率快、耐酸、耐乙醇的醋酸菌以及設(shè)計(jì)新型、產(chǎn)酸效率高的發(fā)酵罐等，但對(duì)改善液態(tài)發(fā)酵食醋口感和風(fēng)味方面的研究較少。有研究[5-6]在傳統(tǒng)食醋醋醅中篩選了能夠耐受10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇、3%乙酸、40 ℃溫度的醋酸菌，并將其用于西瓜醋的釀造；吳光忠等[7]采用獼猴桃和糯米為原料釀造果香型米醋，改善了米醋的風(fēng)味品質(zhì)；方冠宇[8]研究了不同發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)對(duì)浙江玫瑰醋品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)用氣動(dòng)攪拌發(fā)酵罐釀造的玫瑰醋與傳統(tǒng)玫瑰醋最接近。

我國(guó)傳統(tǒng)食醋釀造過(guò)程中，大量乳酸菌參與了發(fā)酵，能夠產(chǎn)生適量乳酸，柔和食醋酸感，同時(shí)促進(jìn)食醋產(chǎn)品中多種風(fēng)味物質(zhì)的形成[9-10]。本研究嘗試在液態(tài)發(fā)酵食醋生產(chǎn)前期，將麩皮浸出液用乳酸菌靜置發(fā)酵，然后加入米酒并接種醋酸菌啟動(dòng)醋酸發(fā)酵。通過(guò)增加底物和微生物種類，以期達(dá)到改善液態(tài)發(fā)酵米醋風(fēng)味品質(zhì)的目標(biāo)，為優(yōu)化米醋釀造工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麩皮和米酒由江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司提供，其中米酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%。

氫氧化鈉、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇、草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)菌種見(jiàn)表1。

表1 本研究所用菌種信息Table 1 Information about bacterial strains used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；e2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 米醋的液態(tài)發(fā)酵

麩皮浸出液的制備：將麩皮與水按質(zhì)量比1∶4混合，超聲處理20 min，用雙層紗布過(guò)濾，得到麩皮浸出液。

乳酸發(fā)酵：取50 mL麩皮浸出液，分別接種10 株不同的乳酸菌，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵24 h，得到乳酸發(fā)酵液。

醋酸發(fā)酵：實(shí)驗(yàn)組取40 mL乳酸發(fā)酵液，對(duì)照組取40 mL麩皮浸出液，分別加入60 mL米酒，并接種醋酸菌，置于30 ℃全溫?fù)u瓶柜中，轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行醋酸發(fā)酵。

1.3.2 總酸的測(cè)定

參考GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[11]。

1.3.3 有機(jī)酸的測(cè)定

參考GB/T 18623—2011《國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品 鎮(zhèn)江香醋》[12]。

1.3.4 揮發(fā)性化合物的檢測(cè)[13]

樣品預(yù)處理：取1 mL米醋加入20 mL頂空萃取瓶中，加5 mL水、2.5 g氯化鈉、10 μL 2-辛醇內(nèi)標(biāo)（25 mg/L），放入1 顆磁力攪拌子，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃水浴預(yù)熱5 min，隨后將老化過(guò)后的萃取頭插入萃取瓶，50 ℃頂空萃取40 min。

氣相色譜條件： 色譜柱：DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，柱流量1 mL/min，不分流；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，然后以10 ℃/min升至240 ℃，保持5 min，后運(yùn)行溫度240 ℃，后運(yùn)行5 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃，連接桿溫度150 ℃；離子源為電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z33～450；ACQ方式Scan。

定性方法：將測(cè)得的質(zhì)譜圖與NIST17.L譜庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)，確認(rèn)各個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分。

定量方法：采用半定量的方法，以測(cè)得的2-辛醇內(nèi)標(biāo)峰面積與被測(cè)物峰面積比值計(jì)算米醋中各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.3.5 米醋的感官評(píng)價(jià)[14-16]

由10 名（5 男，5 女）經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員組成感官評(píng)價(jià)小組，按照表2的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（100 分制）對(duì)所得的11 個(gè)米醋樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以平均得分為最終結(jié)果。

表2 米醋感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of rice vinegar

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）在線工具進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵麩皮浸出液的總酸及有機(jī)酸組成

麩皮是固態(tài)發(fā)酵食醋釀造的重要輔料之一，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括小分子糖類、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等[17-18]。表3為麩皮浸出液經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵24 h后發(fā)酵液的總酸和有機(jī)酸組成。麩皮浸出液的總酸為1.62 g/L（以乳酸計(jì)），以酒石酸為主要有機(jī)酸；經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后，總酸為7.2～14.5 g/L（以乳酸計(jì)）；有機(jī)酸組成發(fā)生了明顯改變，乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸含量顯著上升，而草酸和丙酮酸含量變化不明顯。短乳桿菌L-02的產(chǎn)酸能力最弱，而副干酪乳桿菌L-06的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。

表3 乳酸菌發(fā)酵24 h后總酸及有機(jī)酸組成Table 3 Total acidity and organic acid composition of lactic acid bacteria-fermented bran leachate at 24 h

2.2 醋酸發(fā)酵過(guò)程的總酸變化

圖1 醋酸發(fā)酵過(guò)程總酸變化Fig. 1 Changes in total acidity during acetic acid fermentation

從圖1可知，所有實(shí)驗(yàn)組醋酸發(fā)酵起始時(shí)總酸質(zhì)量濃度（以乙酸計(jì)）為5.0 g/L左右，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，總酸逐漸升高，到第6～8天時(shí)達(dá)50.0 g/L左右。與對(duì)照組相比，羅伊氏乳桿菌L-05和橋乳桿菌L-09強(qiáng)化組的產(chǎn)酸速率相似，但嗜酸乳桿菌L-10、發(fā)酵乳桿菌L-03和植物乳桿菌L-04強(qiáng)化組的產(chǎn)酸速率較慢，這可能與嗜酸乳桿菌等乳酸菌能產(chǎn)生細(xì)菌素、類細(xì)菌素和過(guò)氧化氫等抑菌物質(zhì)有關(guān)[19-21]。

2.3 液態(tài)發(fā)酵米醋的有機(jī)酸組成

表4 液態(tài)發(fā)酵米醋的有機(jī)酸組成Table 4 Organic acid composition of rice vinegar

如表4所示，各組液態(tài)發(fā)酵米醋的有機(jī)酸組成均以乙酸為主。接種乳酸菌發(fā)酵的麩皮浸出液后，液態(tài)發(fā)酵米醋含有乳酸，另有少量琥珀酸、酒石酸和檸檬酸，基本不含草酸和丙酮酸。

2.4 液態(tài)發(fā)酵米醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分析

圖2 米醋代表性樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig. 2 Total iron current chromatograms of volatile compounds in representative samples of rice vinegar

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)11 個(gè)米醋樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，圖2為其中3 個(gè)代表性米醋樣品的總離子流圖，可以看出在該檢測(cè)條件下樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分離度良好。

食醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種數(shù)和含量可以影響風(fēng)味的復(fù)雜性[22-23]。與對(duì)照組相比，短乳桿菌L-02、發(fā)酵乳桿菌L-03、植物乳桿菌L-04和羅伊氏乳桿菌L-05強(qiáng)化組中酯類、醇類、酮類和含氮類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類明顯更多，而其他乳酸菌強(qiáng)化組的揮發(fā)性酸類風(fēng)味物種數(shù)則比對(duì)照組少（圖3A）。

與對(duì)照組相比，除嗜酸乳桿菌L-10強(qiáng)化組外，其他乳酸菌強(qiáng)化組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量更高，這主要是由于酯類、醇類、醛類和酮類的含量升高導(dǎo)致，嗜酸乳桿菌L-10強(qiáng)化組的醇類物質(zhì)含量升高，但酮類物質(zhì)含量明顯下降（圖3B）。

圖3 液態(tài)發(fā)酵米醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類（A）和含量（B）分布Fig. 3 Types (A) and contents (B) of volatile compounds in rice vinegar

如圖4所示，從11 個(gè)食醋樣品中共檢測(cè)到了81 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、醚類、烷類、含氮類和雜環(huán)類10大類，主要為酯類物質(zhì)（27 種）和醇類物質(zhì)（17 種）。 酯類物質(zhì)中乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯和丁二酸二乙酯含量最高，它們能賦予食醋水果香氣[24-25]；醇類物質(zhì)中苯乙醇、異戊醇和2,3-丁二醇含量最高，苯乙醇具有玫瑰花香和蜜香，異戊醇具有醇味和澀味，2,3-丁二醇具有焦香和奶油香氣[26]；乙酸是食醋中最重要的物質(zhì)，也是最主要的揮發(fā)性酸類物質(zhì)；苯甲醛是最主要的醛類物質(zhì)，其具有杏仁香氣[27]；3-羥基-2丁酮和2,3-丁二酮是兩種最主要的酮類物質(zhì)，都具有奶油香氣[28-32]。

根據(jù)聚類分析結(jié)果（圖5），11 個(gè)米醋樣品可以被分為3 個(gè)大類，其中直接以麩皮浸出液與米酒混合接種醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵釀造的食醋被單獨(dú)聚為一類，短乳桿菌L-02、發(fā)酵乳桿菌L-03和羅伊氏乳桿菌L-05強(qiáng)化組被聚為一類，其他乳酸菌強(qiáng)化組被聚為一類。

圖4 米醋揮發(fā)性化合物組成Fig. 4 Composition of volatile compounds of rice vinegar

圖5 米醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量聚類分析Fig. 5 Cluster analysis of concentrations of volatile flavor compounds of rice vinegar

2.5 米醋感官評(píng)價(jià)結(jié)果

圖6 米醋感官評(píng)分結(jié)果Fig. 6 Results of sensory evaluation of rice vinegar

如圖6所示，所有米醋的色澤和體態(tài)得分均在20 分以上，視覺(jué)觀察差異不大；但滋味和風(fēng)味的得分有較大差異，羅伊氏乳桿菌L-05強(qiáng)化組得分最高，短乳桿菌L-02強(qiáng)化組得分次之，而未強(qiáng)化組乳酸桿菌的對(duì)照組BL的得分最少。這表明，乳酸菌強(qiáng)化能改善米醋的風(fēng)味品質(zhì)，其中強(qiáng)化羅伊氏乳桿菌L-05的效果最佳。

3 結(jié) 論

本研究將不同乳酸菌發(fā)酵麩皮浸出液后，將其與米酒混合并接種醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵釀造米醋。結(jié)果表明，不同乳酸菌發(fā)酵均能夠增加米醋中乳酸含量，其中羅伊氏乳桿菌L-05和橋乳桿菌L-09強(qiáng)化組產(chǎn)酸速率比對(duì)照快；短乳桿菌L-02、發(fā)酵乳桿菌L-03和羅伊氏乳桿菌L-05強(qiáng)化能增加米醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量。本研究為乳酸菌強(qiáng)化改善液態(tài)發(fā)酵米醋的風(fēng)味提供了理論支持。