張 璇，安 峰，馬 賽，劉振麗，劉 博

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.口腔科；2.病理科，河北 張家口 075000)

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是腺源性惡性腫瘤，臨床較為多見。它的發(fā)生和發(fā)展相對較慢，但具有以下特征：強(qiáng)烈的侵襲性，易于沿神經(jīng)傳播，可以侵入血管內(nèi)，經(jīng)常復(fù)發(fā)和可伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。根據(jù)SACC在顯微鏡下的組織學(xué)形態(tài)的不同，可將其劃分為兩型，分別為分化相對良好的腺樣/管狀型和分化較差的實性型。由于現(xiàn)階段的研究水平有限，對該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚不明了，并且該腫瘤侵襲性較強(qiáng)，使得該腫瘤的治療難度加大，并且無法獲得理想的預(yù)后，無法保證較長的生存時間。因此，為了得到有效的治療和理想的預(yù)后，對SACC做深入研究很有必要。活化的Cdc42相關(guān)酪氨酸激酶1(activated Cdc42-associated tyrosine kinase 1，Ack1)過度表達(dá)可激發(fā)細(xì)胞的腫瘤基因，使其活性和侵襲性增加。基質(zhì)金屬蛋白酶14(matrix metal loproteinase-14，MMP-14)的降解活性是細(xì)胞周圍環(huán)境的有效調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲。本研究應(yīng)用免疫組化SABC技術(shù)檢測Ack1和MMP-14在SACC、涎腺正常組織中的表達(dá)水平，分析兩者與SACC的關(guān)系，并研究兩者之間是否存在相關(guān)性，探尋其在SACC發(fā)生發(fā)展中可能存在的機(jī)制。

1 資料及方法

1.1 資料 實驗組的標(biāo)本采集：收集2013年6月～2018年6月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本蠟塊。所有標(biāo)本在術(shù)后均經(jīng)病理檢查，診斷為SACC，共49例。病例的臨床資料詳實且術(shù)前3個月內(nèi)未接受相關(guān)抗癌治療。其中男28例，女21例；年齡43～75歲，中位年齡58歲，≥58歲25例，<58歲24例；組織學(xué)(2005年制定的病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn))類型管狀/篩孔型29例，實性型20例；臨床分期(UICC唾液腺癌TNM分類分期，2011)Ⅰ～Ⅱ22例，Ⅲ～Ⅳ27例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，未轉(zhuǎn)移39例；神經(jīng)系統(tǒng)侵犯21例，未侵犯28例。

對照組的標(biāo)本采集：收集手術(shù)中切除的24例涎腺正常組織作為本研究的對照標(biāo)本。

1.2 試劑 上海雅吉生物科技有限公司購買兔抗人Ack1親和抗體，武漢維克賽思科技有限公司購買兔抗人MMP-14親和抗體、SABC檢測試劑盒、DAB試劑。

1.3 免疫組化 以4 μm的厚度將所有標(biāo)本(實驗組及對照組蠟塊)制成實驗切片。切片脫蠟至水后在枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS緩沖液沖洗，每次5 min，沖洗2次。一抗Ack1、MMP-14稀釋濃度均為1∶200，進(jìn)行SABC法染色(按照說明書操作)，蘇木精復(fù)染，脫水封片。

1.4 結(jié)果判定 免疫反應(yīng)評分法(IRS)對實驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分。具體方法為PP：實驗切片中陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的百分比，SI：實驗切片中細(xì)胞的染色強(qiáng)度，兩者相乘計算出最終得分(IRS=PP×SI)。在每個切片中選擇200倍的隨機(jī)高倍鏡視野10個，并計算出陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞比例，取平均數(shù)：無陽性細(xì)胞PP計0分，03表示高表達(dá)，≤3表示低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗，指標(biāo)間相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ack1、MMP-14在SACC及涎腺正常組織中的表達(dá) 陽性表達(dá)產(chǎn)物：Ack1的染色部位主要集中在細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中，MMP-14的染色部位大多集中在細(xì)胞的胞質(zhì)中。

以免疫組化SABC技術(shù)所檢測到的Ack1、MMP-14在SACC中的表達(dá)情況見圖1、2。

圖1 Ack1在SACC中的表達(dá)(×100)

圖2 MMP-14在SACC中的表達(dá)(×100)

2.2 Ack1、MMP-14在SACC組織中的表達(dá)情況及與SACC各臨床病理因素之間的相關(guān)性 在SACC組織中，Ack1、MMP-14的陽性細(xì)胞表達(dá)率分別是63.3%、67.3%。在涎腺正常組織中的陽性細(xì)胞表達(dá)率分別是33.3%、37.5%，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

在SACC組織中，Ack1、MMP-14的表達(dá)水平同患者性別和年齡無關(guān)(P>0.05)。但與腫瘤的組織學(xué)類型、臨床分期、腫瘤細(xì)胞是否會侵犯到頸部淋巴結(jié)以及是否轉(zhuǎn)移至周圍神經(jīng)有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3 SACC組織中Ack1、MMP-14的關(guān)系 在SACC組織標(biāo)本中檢測到Ack1、MMP-14同為陽性表達(dá)25例，同為陰性表達(dá)10例。兩者在SACC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.372)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 SACC組織及涎腺正常組織中Ack1、MMP-14的表達(dá)情況及與臨床病理因素之間的相關(guān)性

3 討論

Ack1由Edward等發(fā)現(xiàn)，是一種非受體型的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，在癌細(xì)胞存活以及腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。酪氨酸激酶是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其活性受到嚴(yán)格控制。染色體易位、過表達(dá)或活化突變引起的酪氨酸激酶信號失調(diào)可能導(dǎo)致激酶活性和惡性轉(zhuǎn)化的紊亂。其活化可導(dǎo)致細(xì)胞不依賴生長因子而大量生長繁殖，細(xì)胞凋亡抑制，血管生成，侵襲和轉(zhuǎn)移。酪氨酸激酶的異常激活與人類癌癥有因果關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Ack1在人乳腺癌[2]、食管癌[3]、前列腺癌[4]和其他腫瘤組織中具有各種水平的表達(dá)上調(diào)。在胃癌組織中更是存在明顯的表達(dá)上調(diào)[5]。Van等[6]通過實驗發(fā)現(xiàn)，在相當(dāng)一部分的人類腫瘤中，包括Ack1基因序列在內(nèi)的DNA片段堿基對的基因拷貝數(shù)目顯著增加，并證實了Ack 1基因的明顯擴(kuò)增。Phillips等[7]發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟腫瘤中的一系列基因(包括Ack1)通過苯巴比妥的刺激，會發(fā)生明顯的低甲基化。這種變化是由于腫瘤基因表達(dá)上調(diào)引起的。本研究顯示，Ack1在SACC組織中的表達(dá)水平增高，且同SACC的組織學(xué)類型、臨床分期、腫瘤細(xì)胞是否會侵犯到頸部淋巴結(jié)以及是否轉(zhuǎn)移至周圍神經(jīng)有關(guān)，這表明Ack1可作為判斷SACC病情進(jìn)展的一個依據(jù)。

MMP-14又被稱為MT1-MMP，是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)蛋白質(zhì)家族的成員。MMP是鋅結(jié)合的內(nèi)肽酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞外空間中許多蛋白質(zhì)的降解更新。大多數(shù)的腫瘤和其周圍的基質(zhì)細(xì)胞會過度表達(dá)MMP，從而更易突破細(xì)胞基底膜(BM)和降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，這是促進(jìn)腫瘤生長、局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素[8]。相關(guān)研究表明，MMP-14在多種人類腫瘤中的表達(dá)水平相比正常組織增高，如結(jié)腸癌[9]、肺癌[10]、宮頸癌[11]等，這是由于癌細(xì)胞上調(diào)了MMP-14的表達(dá)和活性，而MMP-14參與各種腫瘤相關(guān)的ECM的分解，并在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中及高度侵襲性腫瘤或晚期中滲透BM，從而分解白介素8、CD44、pro-TNF、膠原蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白等一系列蛋白。通過不同的信號傳導(dǎo)功能(包括凋亡、血管生成和免疫)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究顯示，MMP-14的表達(dá)水平與SACC的組織學(xué)類型、臨床分期、腫瘤細(xì)胞是否會侵犯到頸部淋巴結(jié)及是否轉(zhuǎn)移至周圍神經(jīng)有關(guān)。提示MMP-14在SACC 組織中同樣可以降解ECM，并同其他致癌基因一起突破BM，分解抑癌基因，從而加劇腫瘤的惡性程度及浸潤程度，使病情惡化。

將SACC組織中Ack1、MMP-14的表達(dá)水平進(jìn)行綜合性的統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)(r=0.372,P=0.009)，提示兩者間可能存在通路關(guān)系，可能原因為SACC在侵襲及擴(kuò)散過程中的物理屏障被MMP-14消除，為Ack1基因的擴(kuò)增提供機(jī)會，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)。但Ack1與MMP-14在SACC的發(fā)生過程中的具體機(jī)制仍需深入研究確定。

綜上所述，Ack1、MMP-14在SACC組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，并與部分臨床病理因素密切相關(guān)。在SACC組織中兩者的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。通過分析Ack1、MMP-14在SACC 中的表達(dá)水平，有助于我們對SACC的臨床診斷。