趙星云 卞茂紅

miRNA是一種內(nèi)源性長約21～26個堿基的非編碼單鏈小分子RNA[1]。它在紅細胞的生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡的過程中參與調(diào)控。以下是對miRNA參與紅系凋亡機制的介紹。

1 miRNA

1.1 miRNA的生成與作用：在細胞核內(nèi)，編碼miRNA的基因先轉(zhuǎn)錄成原始miRNA轉(zhuǎn)錄本，其在RNaseⅢ核酸酶Drosha的作用下，被剪切成約70 nt的發(fā)夾狀前體miRNA(premiRNA)。pre-miRNA再從核內(nèi)運輸?shù)桨|(zhì)中，被核酸酶Dicer剪切成長約22個核苷酸的雙螺旋miRNA。隨后雙螺旋解旋，互補鏈立即被降解，另一條鏈即為成熟的miRNA分子[2]。miRNA通過與靶基因的3'-末端非編碼區(qū)不完全互補配對來完成對下游基因的調(diào)節(jié)。對于互補配對程度高的靶基因（如大多數(shù)植物中），miRNA對靶基因mRNA進行切割，而對于互補配對程度低的靶基因（如大多數(shù)動物中），miRNA則對靶基因mRNA進行翻譯抑制[3]。

1.2 miRNA功能鑒定的方法與材料：對miRNA進行功能鑒定的方法，主要有微陣列芯片技術(shù)、實時PCR和RNA測序[4]，它們的完美結(jié)合可用于紅細胞中miRNA在不同階段的分析。另外，新一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)在miRNA功能鑒定方面的應(yīng)用也得到了發(fā)展[5]。在這些技術(shù)中，往往需要首先調(diào)節(jié)miRNA在紅細胞中的表達量或表達活性，才能進一步分析miRNA的功能，而這一過程即為功能獲得與喪失試驗的核心步驟。其中功能獲得試驗是將RNA低聚體注入斑馬魚的胚體中來促進內(nèi)源性miRNA表達；而功能喪失試驗則是通過向斑馬魚胚胎中注入嗎啉代來抑制內(nèi)源性miRNA表達[6]。相類似的還有：miRNA前體的異常表達、質(zhì)粒或病毒載體編碼的抑制劑以及模擬的或反義的寡核苷酸等，它們都可以用于功能獲得與喪失試驗，為分析miRNA功能提供有效信息[7]。

在鑒定過程中主要使用的實驗材料有細胞株（CD34+造血干細胞、K562細胞和小鼠紅白血病細胞等）[8-10]，工具酶（限制性內(nèi)切酶、溶菌酶和Taq DNA聚合酶等），以及相關(guān)的細胞因子、引物等。

1.3 miRNA靶基因的預測：對miRNA靶基因進行預測可以在分子水平了解miRNA的作用。最常用的是生物信息學方法，預測軟件包括Targetscan、Pictar、miRanda、miRDB等[11]。雖然預測miRNA靶基因的軟件在不斷升級，但仍有一定的局限性。

而實驗分析方法則是通過比較某miRNA過表達的細胞與對照細胞中轉(zhuǎn)錄組與蛋白組水平來預測其靶基因的。其中，基因芯片分析法就是在轉(zhuǎn)錄組的水平上，通過瞬時轉(zhuǎn)染或反義核酸等方法來調(diào)節(jié)miRNA活性，之后再利用基因芯片分析mRNA的變化進而找出相應(yīng)miRNA的靶基因[12]。而SILAC技術(shù)（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）則通過查看轉(zhuǎn)染miRNA后的蛋白表達水平變化來預測其靶基因[13,14]。

1.4 miRNA靶基因的驗證：最直接的方法就是在轉(zhuǎn)染或敲除miRNA后，利用熒光定量PCR或Western blot[15,16]，分別監(jiān)測細胞中mRNA水平或蛋白水平的變化，從而確定miRNA與靶基因的對應(yīng)關(guān)系。這些方法能夠直接鑒定出miRNA的靶基因，準確度高，但無法鑒定出miRNA的靶位點。

目前最常用的方法是熒光素酶報告基因法[17,18]。該方法首先構(gòu)建熒光素酶表達載體，將需要鑒定的miRNA靶基因3'UTR插入熒光素酶基因3'UTR中，然后將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)染到細胞中，從而改變miRNA的表達水平，最后檢測熒光素酶的表達情況，以分析3'UTR中是否含有miRNA的靶位點。

2 miRNA與紅系的生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡相關(guān)性

miRNA可以通過下調(diào)某些靶基因及蛋白的表達來調(diào)節(jié)紅系的生長發(fā)育、增殖、分化及凋亡[19]。

2.1 miRNA與紅系生長發(fā)育相關(guān)性

2.1.1 miR-144/451：miR-144和miR-451表達量在斑馬魚、小鼠及人類的紅系生長發(fā)育過程中均有所增加[20-22]。當miR-451被敲除時，可延遲紅系的生長發(fā)育及分化[23,24]。在斑馬魚體內(nèi)，miR-144通過與Kruppel樣因子結(jié)合來調(diào)節(jié)α血紅蛋白的合成[25]，而miR-451則是通過與靶基因gata2結(jié)合來調(diào)節(jié)紅細胞成熟[26]。當miR-144/451下調(diào)時，紅系的生長發(fā)育將受到一定程度上的抑制。

2.1.2 miR-142：miR-142可以在一定程度上調(diào)節(jié)紅細胞的形態(tài)、脆性及壽命，尤其是在調(diào)節(jié)紅細胞骨架方面有著重要作用。缺乏miR-142的紅細胞，其所含有的維持細胞結(jié)構(gòu)的蛋白下調(diào)，在通過血管時，紅細胞變形性下降，細胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，更易破碎。同時，miR-142還可用于抵抗氧化應(yīng)激，盡管這一機制尚不明確?？偟膩碚f，當紅細胞內(nèi)缺乏miR-142時，該紅細胞更易出現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)、異常的機械調(diào)節(jié)，也更易受到氧化應(yīng)激對細胞本身的傷害[27]。

2.1.3 miR-191：在紅細胞分化的終末階段，很多miRNA下調(diào)，而miR-191異常增多，其在紅細胞的增殖與分化過程中基本沒有參與，但在脫核過程中起著重要的作用。研究表明，miR-191在小鼠紅細胞中直接與Riok3及Mxi1等基因相關(guān)。當敲除Riok3與Mxi1時，miR-191上調(diào)，將阻止Gcn5的下調(diào)，從而阻止紅細胞的脫核過程[28]。

2.2 miRNA與紅系增殖、分化相關(guān)性

2.2.1 miR-223：在紅細胞增殖和分化的過程中，miR-223表達下降將會導致晚幼紅細胞的減少。LMO2是其靶基因，可編碼一種蛋白，該蛋白是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄多聚體復合物的一部分，用于調(diào)節(jié)紅系分化相關(guān)的基因表達。當miR-223下調(diào)時，其對靶基因的抑制解除，通過編碼相關(guān)蛋白，從而促進紅系增殖、分化[29]。

2.2.2 miR-126/126*：miR-126及其互補序列miR-126*起源于EGFL7第七內(nèi)含子，并特異性高表達于血管內(nèi)皮細胞，可促進胚胎時期的血管新生及維持血管的完整性。在體內(nèi)試驗中，miR-126/126*在定向造血干細胞中的表達量較多，但隨著細胞生長發(fā)育，其表達量逐漸減少。這提示miR-126/126*在紅系生長發(fā)育及分化過程中，起到抑制作用。PTPN9蛋白作為miR-126/126*的靶基因，有著促進紅細胞增殖及分化的作用。即PTPN9一定程度上可以解除miR-126/126*對紅系分化的抑制[30]。

2.2.3 miR-200a：miR-200a的表達量在紅系分化過程中逐漸減少，生物信息學及試驗分析得知PDCD4和THRB都是miR-200a-3p的靶基因。對PDCD4和THRB進行功能獲得與喪失試驗顯示這兩個靶基因可促進紅系基因的表達量。也就是說，miR-200a通過對PDCD4和THRB的調(diào)節(jié)來抑制紅系分化[31]。

2.2.4 miR-320a：miR-320a通過與靶基因SMAR1結(jié)合來抑制紅系分化。另外，SMAR1還可以通過與miR-221/222結(jié)合來調(diào)節(jié)紅系分化，其中miR-221/222在早期紅系分化中有重要作用[32]。因此，當miR-320a上調(diào)時，可以通過與靶基因SMAR1結(jié)合來抑制紅系分化，也可以通過miR-221/222的路徑來調(diào)節(jié)紅系分化。

2.3 miRNA與紅系凋亡相關(guān)性

2.3.1 miR-503：凋亡是細胞維持正常發(fā)育及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的生理性死亡。miRNA的異常表達將引起異常的凋亡，最終導致貧血或癌癥的發(fā)生。紅細胞生命代謝過程中miR-503參與調(diào)控細胞周期阻滯和凋亡[33,34]。Roy等[35]對CD34+造血干細胞體外分化得到的CD235a+紅細胞內(nèi)miR-503進行檢測，發(fā)現(xiàn)β-地中海貧血患者細胞內(nèi)miR-503表達水平顯著下調(diào)，且病情越重則miR-503表達水平越低。正常情況下miR-503能通過抑制細胞增殖基因CDC25A的表達使紅細胞的細胞周期靜止。由于地中海貧血患者紅細胞分化過程中miR-503表達量很低，無法有效抑制CDC25A的功能進而導致無效紅細胞的生成和過度增殖。

3 展望 盡管對紅系生命代謝過程中所參與miRNAs的了解較過去有所增加，但對于它們的功能及其靶基因的探究仍是未來的巨大挑戰(zhàn)，這將為研究紅系分化提供新的思路。與此同時，通過完善紅細胞生命代謝的調(diào)節(jié)機制，將為貧血等紅系疾病提供新的治療方案[36]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突