閻其均 翁羽 朱付英

肝癌是我國臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)生率及死亡率較高，是威脅人類健康的重大疾病之一[1]。肝癌早期常無典型癥狀，多數(shù)患者明確診斷時已處于中晚期，錯失最佳治療時機，嚴(yán)重影響患者生存率。因此，對肝癌早期診斷、及時治療顯得尤為重要。

對穿刺獲取或手術(shù)切除的病灶組織進行病理學(xué)檢查是診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但肝穿刺會對患者造成一定程度損傷，另手術(shù)切除獲取病理組織的方法只適用于確定行肝切除術(shù)的患者，因此，肝組織活檢在臨床診斷的應(yīng)用中受到一定限制。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是指自發(fā)或因診療操作而進入血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，cfDNA是指存在于外周血液的胞外DNA。CTCs和cfDNA對腫瘤的早期篩查及預(yù)后評估具有重要價值，可通過非侵入性操作取樣，被稱為“液體活檢”[2]。有研究[3-5]表明，腫瘤患者血漿循環(huán)游離DNA（cfDNA）水平顯著高于正常人；原發(fā)性肝癌患者外周血中含有CTCs；血漿cfDNA檢測在胃癌的臨床診斷中具有一定輔助作用。基于此，本研究探討外周血CTCs聯(lián)合cfDNA檢測在早期肝癌篩查中的應(yīng)用價值，為臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供參考依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 選取我院2017年9月～2019年8月收治的182例高度疑似肝癌患者，其中男117例，女65例，年齡23～81歲，平均（48.96±8.17）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：有肝區(qū)疼痛、食欲下降、腹脹、發(fā)熱或乏力消瘦等癥狀，觸診時發(fā)現(xiàn)肝腫大或上腹部包塊，超聲或CT、MRI檢查發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)有實質(zhì)性占位者；入院后均接受外周血CTCs、cfDNA檢測；意識清楚，無精神疾?。痪橥馇易栽竻⑴c。排除標(biāo)準(zhǔn)：有心肺腎等重要臟器疾病者；入院時已發(fā)現(xiàn)其他部位腫瘤或出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移者；有血液系統(tǒng)疾病者；納入研究前1年曾接受過化療、免疫治療等。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批。

2 方法

2.1 試劑及儀器：血漿DNA提取試劑盒購自北京金麥格生物有限公司，抗熒光淬滅劑購自美國CST公司，紅細(xì)胞裂解液購自中國SurEXam公司，甲醛溶液購自成都民生消毒劑有限公司，離心機購自Thermo公司，熒光顯微鏡購自日本尼康（Nikon）公司。血漿DNA提取試劑盒購自上海歐孚生物科技有限公司，SYBR Green Real Master Mix購自北京天根公司，離心機購自Thermo公司，分光光度計購自Thermo公司，熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

2.2 外周血CTCs檢測：用EDTA-K2抗凝管采集患者術(shù)前空腹血5 mL，混勻后將5 mL血液置于樣本保存管內(nèi)，室溫下放置30 min后離心5 min（3 000 r/min），棄上清，將管內(nèi)剩余液體經(jīng)過濾器過濾后，用甲醛溶液在室溫下固定60 min；在24孔板中加入紅細(xì)胞裂解液，將濾膜放入其中，室溫孵育，去除液體，PBS沖洗3次；然后將濾膜放置入含探針工作液的24孔板中，40℃孵育3h，去除液體，洗滌3次，再將濾膜放入含擴增緩沖液的24孔板中，40℃孵育3 min，去除液體，洗滌3次，加入含顯色工作液的24孔板中，40℃孵育30 min，去除液體，洗滌，最后將濾膜細(xì)胞面朝上而放置于載玻片上，在樣本上加入抗熒光淬滅劑（含DAPI）后，放置5 min，在顯微鏡下觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：細(xì)胞內(nèi)CD45(-)、EpCAM(+)、CK8/18/19(+)，顯微鏡下呈紅色熒光信號，則判斷為上皮型CTCs；細(xì)胞內(nèi)CD45(-)、vimentin(+)、twist(+)，顯微鏡下呈綠色熒光信號，則判斷為間質(zhì)性CTCs；若細(xì)胞內(nèi)同時呈現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光信號，則判斷為混合型CTCs。

2.3 外周血cfDNA檢測：用EDTA-K2抗凝管采集患者靜脈血5 mL，離心15 min（3 000 r/min）分離血漿；以人基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外分光光度計對其原始濃度進行測量，倍比稀釋其濃度至400 ng/mL、40 ng/mL、4 ng/mL、0.4 ng/mL、0.04 ng/mL。內(nèi)參使用ALU重復(fù)序列，引物序列上游：5'-CCTGAGGTAAGGTCAGCGAG-3'，下游：5'-CCCGAGTAAGGAGGATTACA-3'。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測樣品進行定量檢測，PCR總體系為20 μL，包括9 μL的SYBR Green Real Master Mix、上下游引物各1 μL、蒸餾水7 μL、模板2 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min；94℃30s，62℃20s，72℃30s，共45個循環(huán)。所有樣本均設(shè)3復(fù)孔，取其平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件，計量資料用（ ±s）表示，兩樣本比較采用t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析；外周血CTCs、cfDNA水平與肝功能指標(biāo)、相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析；另采用ROC曲線分析外周血CTCs、cfDNA聯(lián)合檢測對早期肝癌的篩查價值；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 外周血CTCs、cfDNA檢測結(jié)果 182例患者外周血CTCs平均為（3.45±0.69）個/5 mL，cfDNA平均為（17.26±3.51）ng/mL。

2 癌癥組與良性組患者肝功能及腫瘤標(biāo)志物水平比較根據(jù)病理學(xué)結(jié)果診斷分為癌癥組139例，良性組43例（肝囊腫10例、肝膿腫13例、肝內(nèi)膽管結(jié)石15例、肝血管瘤5例）。癌癥組血清AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均高于良性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3 癌癥組與良性組患者外周血CTCs、cfDNA水平比較 癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平均高于良性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 癌癥組與良性組患者肝功能及腫瘤標(biāo)志物水平比較（ ±s）

表2 癌癥組與良性組患者外周血CTCs、cfDNA水平對比（ ±s）

4 癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與肝功能指標(biāo)及腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均呈正相關(guān)性（P＜0.05），見表3。

5 肝癌不同分期外周血CTCs、cfDNA水平比較 肝癌不同分期外周血CTCs、cfDNA水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），外周血CTCs、cfDNA水平肝癌Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，見表4。

表3 癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與肝功能指標(biāo)及腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

6 診斷效能 經(jīng)ROC曲線分析，外周血CTCs診斷肝癌的cut-off值為4個/5 mL，其靈敏度、特異度、AUC分別為75.54%、86.05%、0.854；外周血cfDNA診斷肝癌的cut-off值為19.38 ng/mL，其靈敏度、特異度、AUC分別為78.42%、79.07%、0.831；外周血CTCs聯(lián)合cfDNA診斷肝癌的靈敏度、特異度、AUC分別為82.01%、90.70%、0.923。見圖1及表5。

表4 肝癌不同分期之間外周血CTCs、cfDNA對比（ ±s）

表5 外周血CTCs、cfDNA單項及聯(lián)合檢測對肝癌的診斷效能

討 論

肝癌屬消化系統(tǒng)惡性腫瘤，多由病毒性肝炎、酒精性肝硬化或長期攝入黃曲霉素及亞硝胺等化學(xué)致癌物質(zhì)所導(dǎo)致[7]。肝癌發(fā)病較為隱匿，初期多無明顯癥狀，如何提高肝癌早期診斷率仍是現(xiàn)階段臨床關(guān)注的重點、熱點問題[8]。肝組織活檢是確診肝癌的重要手段，但因其有創(chuàng)傷性，臨床應(yīng)用受到限制。因此，積極尋求早期篩查肝癌的其他方法具有重要的臨床價值。

本研究中，182例高度疑似肝癌患者中確診為肝癌的有139例，確診為肝臟良性病變的有43例。與良性組比較，癌癥組外周血CTCs、cfDNA水平明顯升高，且CTCs、cfDNA水平隨著肝癌分期逐漸升高，提示肝癌患者外周血CTCs、cfDNA水平異常上升，與肝癌臨床分期密切相關(guān)。CTCs包括從腫瘤原發(fā)病灶、轉(zhuǎn)移病灶脫落及診療操作導(dǎo)致進入血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[9]。有研究[10]顯示，在肝細(xì)胞癌形成和生長早期，即有腫瘤細(xì)胞從實體瘤脫落而進入血液循環(huán)，并隨著血行而轉(zhuǎn)移。另有研究[11]顯示，在296例肝細(xì)胞癌患者中，有191例患者（64.53%）外周血中檢測到CTCs，也證實了多數(shù)肝癌患者外周血CTCs含量升高。此外，隨著腫瘤進展，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶增多，釋放入外周血中的CTCs數(shù)量越多。cfDNA主要來源于細(xì)胞壞死或凋亡，與正常細(xì)胞凋亡產(chǎn)生較小的cfDNA片段相比，腫瘤細(xì)胞釋放或腫瘤負(fù)荷狀態(tài)下細(xì)胞壞死產(chǎn)生的cfDNA片段更大更多，這使得檢測cfDNA的敏感性更高[12]。有研究[13]表明，腫瘤患者血液中cfDNA水平顯著高于正常人，且cfDNA含有與腫瘤相關(guān)的某些分子特性或改變。另有研究[14]顯示，肝細(xì)胞癌患者血漿cfDNA濃度中位值顯著高于健康對照者、肝硬化及慢性活動性肝炎患者，本研究結(jié)果與此一致。腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或血行播散，從死亡的癌細(xì)胞釋放入外周血的基因含量越高，因此分期越晚，cfDNA水平越高。另本研究結(jié)果顯示，癌癥組患者外周血CTCs、cfDNA水平與AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均呈正相關(guān)性，表明CTCs、cfDNA水平與肝癌患者肝損傷程度一致。

CTCs來源于腫瘤原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移灶，通過鑒定其計數(shù)及分子特征可一定程度地反映腫瘤特性，可作為腫瘤診斷的標(biāo)記物[15]。原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs與腫瘤體積及腫瘤分期顯著相關(guān)[16]，外周血CTCs計數(shù)有成為診斷原發(fā)性肝癌生物標(biāo)記物的潛在價值[17]。此外，腫瘤生長過程中可持續(xù)釋放cfDNA至外周血中，并維持其來源的分子遺傳性，可通過檢測外周血cfDNA含量反映腫瘤的嚴(yán)重程度[18]。研究也證實[19]，血漿cfDNA在肝癌的臨床診斷中具有一定的靈敏度及特異度。但有研究[20]顯示，進入血液循環(huán)后有部分CTCs在機體免疫作用下發(fā)生凋亡，會導(dǎo)致漏檢的發(fā)生。非腫瘤患者亦可出現(xiàn)cfDNA的改變，且遺傳改變的cfDNA不能反映腫瘤類型及部位，因此，單一檢測診斷價值有限。本研究結(jié)果顯示，單獨檢測外周血CTCs、cfDNA篩查肝癌的靈敏度分別為75.54%、78.42%，特異度分別為86.05%、79.07%，二者聯(lián)合檢測靈敏度、特異度分別為82.01%和90.70%，提示外周血CTCs、cfDNA檢測雖對肝癌有一定的診斷價值，但聯(lián)合檢測時診斷價值更高。

綜上，肝癌患者外周血CTCs、cfDNA明顯升高，與AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平呈正相關(guān)，外周血CTCs、cfDNA水平檢測對肝癌的早期篩查具有一定的臨床價值，但此二者聯(lián)合檢測時的價值更高，可推廣應(yīng)用于臨床中。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突