范艷利， 楊玉民， 牛江秀

(洛陽師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院， 河南洛陽 471934)

生物柴油作為一種可再生、 環(huán)境友好及易于生物降解的生物燃料， 可以緩解與化石燃料有關(guān)的能源危機和環(huán)境污染問題[1]. 目前， 生物柴油的制備方法主要有化學(xué)法、 酶催化法等[2]. 然而， 化學(xué)方法由于能量需求高、 催化劑難回收及環(huán)境壓力大等原因受到限制. 近年來， 酶(脂肪酶)催化法受到越來越多的關(guān)注， 因為這種工藝是在溫和的條件下進行的， 并且對于含有大量脂肪酸的原料也可以使用[2]. 同時， 酶固定化能有效地提高脂肪酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性[3].

近年來， 各種磁性納米復(fù)合材料被廣泛應(yīng)用于酶的固定化方面， 如磁性納米顆粒、 磁性納米管和磁性石墨烯等[4]. 這些材料減少了傳質(zhì)阻力、 簡化了工業(yè)廢物處理， 而且通過簡單的磁體可以實現(xiàn)酶的回收再利用[5]. 磁性碳納米管(m-CNTs)具有納米級尺寸、 高比表面積、 大量極性官能團、 豐富的孔結(jié)構(gòu)、 有效熱傳導(dǎo)性以及生物相容性等優(yōu)點， 已成為研究熱點[6]. 然而， m-CNTs不能為脂肪酶固定化提供足夠的活性位點. 有研究報道， 樹枝狀分子功能化的磁性多壁碳納米管(m-MWANTs-PAMAM)可以提供大量的活性位點， 以提高葡萄糖淀粉酶的固定化率[5].

固定化脂肪酶催化短鏈醇與油脂反應(yīng)制備生物柴油已有大量報道[7]， 其中反應(yīng)介質(zhì)對酶的催化性能有較大影響， 研究較多的是叔丁醇體系[8]和無溶劑體系[9]. 有機溶劑不僅影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)， 而且對酶的結(jié)構(gòu)和活性有很大影響. 在不同溶劑中酶表現(xiàn)出不同的催化活性、 操作穩(wěn)定性、 底物選擇性和動力學(xué)特性. Lu等[10]研究了Candidasp. 99-125在12種不同溶劑中催化甘油三油酸酯甲醇分解反應(yīng)的性能， 發(fā)現(xiàn)影響酶催化的根本原因是有機溶劑的疏水性， 研究結(jié)果顯示， 正辛烷作為介質(zhì)時， 生物柴油產(chǎn)率最高， 接近50%. 在大多數(shù)親水性有機溶劑體系中， 如苯酚、 苯二酚、 N， N-二甲基甲酰胺， 固定化酶RML催化制備的生物柴油得率都不是很高. 有報道已經(jīng)證明， 相對疏水性有機溶劑(logP> 2)作為生物柴油生產(chǎn)的反應(yīng)介質(zhì)時， 酶表現(xiàn)出較高的活性[11]. 然而， 也有研究表明， 溶劑和生物柴油得率之間不呈線性關(guān)系， 它們之間的關(guān)系近似S形曲線[10]. 此外還發(fā)現(xiàn)， 固定化酶RML在叔丁醇體系中表現(xiàn)出良好的催化性， 這可能是因為甘油和甲醇在叔丁醇溶劑中具有良好的溶解度. 故可以削弱甘油和甲醇對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的消極影響， 脂肪酶在這種反應(yīng)介質(zhì)中表現(xiàn)出相當(dāng)較好的穩(wěn)定性. 總體來看， 固定化酶RML催化制備生物柴油得率都低于50%， 可能由于固定化酶RML的催化活性受到過量甲醇的抑制(這個試驗時甲醇是一次性添加的). RML是一種1,3-特異性脂肪酶[12]， 通常以游離、 固定化和全細胞形式作為催化劑用于生物柴油的制備[13].

本文通過共價結(jié)合將RML固定于三代樹枝狀分子PAMAM功能化的磁性多壁碳納米管(m-MWANTs-G3)上， 用于制備生物柴油， 并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化， 以提高轉(zhuǎn)化率.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

GC-9790型氣相色譜儀； 安捷倫HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)； 氫離子檢測器(FID)； N2000氣相色譜工作站； MWCNTs(純度大于95%， 直徑為20～40 nm， 長度小于5 μm， 購自深圳納米港有限公司).

1.1.2 試劑

RML(初始比酶活為4.61×103U/g-protein， 蛋白含量為3.7 mg/mL)， 購自Sigma公司(St. Louis, MO, USA)； 無水甲醇、 正壬烷、 異辛烷、 正辛烷、 正庚烷、 正己烷等有機試劑均為分析純； 去離子水、 m-MWCNTs-G3復(fù)合材料為實驗室自制； 大豆油購自本地超市， 油的成分見表1； 十七烷酸甲酯、 硬脂酸甲酯、 油酸甲酯、 棕櫚酸甲酯、 亞麻酸甲酯、 亞油酸甲酯均為氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)品， 均購于Sigma-Aldrich公司.

1.2 方法

1.2.1 m-MWCNTs-G3復(fù)合材料的活化

將0.1 g m-MWCNTs-G3分散于無水乙醇中， 加入一定量的25%戊二醛， 置于恒溫搖床(200 rpm)中30℃條件下反應(yīng)10 h， 得到醛基活化的m-MWCNTs-G3(m-MWCNTs-G3-GA). 用無水乙醇和去離子水分別洗滌數(shù)次， 最后在60℃真空下干燥24 h， 備用.

1.2.2 脂肪酶的固定化

將100 mg m-MWCNTs-G3-GA加入到磷酸鹽緩沖液(0.05 M， pH=7.0， 4.5 mL)中， 再加入0.5 mL酶液， 超聲作用使之分散均勻. 置于35℃、 200 rpm的恒溫水浴搖床中振蕩反應(yīng)2.5 h， 然后用磁鐵分離固定化酶， 并用過量的緩沖溶液洗滌數(shù)次， 洗去非特異性吸附和未結(jié)合的脂肪酶. 收集殘液以檢測蛋白質(zhì)含量.

1.2.3 生物柴油制備

將2.19 g大豆油加入帶塞子的50 mL錐形瓶中， 加入一定質(zhì)量的固定化酶， 微量磷酸鹽緩沖液和適量醇(所有計量都基于油重)， 搖床轉(zhuǎn)速200 rpm， 在一定反應(yīng)溫度條件下密封振蕩反應(yīng). 定時取樣， 離心后用氣相進行檢測分析. 另外， 為了減弱醇對酶的傷害， 采取醇三次等量添加的方式. 所有試驗重復(fù)三次.

1.2.4 生物柴油檢測

在12000r/min條件下對所取樣品離心處理5 min， 取上清10 μL， 加入300 μL內(nèi)標(biāo)物(1 mg/mL十七碳酸甲酯和正己烷混合溶液)和290 μL正己烷有機溶劑， 混勻； 取1 μL樣品進樣.

INNOWAX毛細管柱， 30 m×0.25 mm×0.25 μm， 柱子溫度以3 ℃/min的速率從初始溫度180℃升高到230℃， 在230℃維持3 min； 進樣口溫度和檢測器溫度分別為230℃和280℃.

生物柴油得率通過以下公式計算[14]：

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆油成分分析

通過GC-MS對大豆油進行定量檢測， 分析結(jié)果如表1所示.

表1 GC-MS分析大豆油中脂肪酸的組成

2.2 脂肪酶的固定化

RML游離氨基與醛基化的復(fù)合材料m-MWCNTs-G3(如圖1所示)通過共價結(jié)合實現(xiàn)固定化. 為了更直觀地觀察酶是否結(jié)合到載體上， 將RML酶用綠色熒光(FITC)進行染色， 借助共聚焦熒光顯微鏡觀察RML酶的固定化情況. 如圖2所示， 圖中的a、 b和c分別表示明場、 暗場和疊加場， 通過疊加場可以很清楚地看到FITC標(biāo)記的RML酶固定到了載體上.

圖1 m-MWCNTs-G3的結(jié)構(gòu)圖

圖2 FITC標(biāo)記的固定化酶的共聚焦熒光圖片(a: 明場， b: 暗場， c: 疊加場)

2.3 m-MWCNTs-G3固定化脂肪酶催化制備生物柴油

將固定化脂肪酶RML&m-MWCNTs-G3用于催化生物柴油的制備. 對影響大豆油轉(zhuǎn)酯制備生物柴油的因素： 加水量、 醇的添加策略、 有機溶劑、 醇油比等進行優(yōu)化， 以獲得最大轉(zhuǎn)化率.

2.3.1 加水量對生物柴油制備的影響

在酶催化反應(yīng)中， 水對酶的穩(wěn)定性和催化活性有重要的影響[15]. 水不僅參與轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程進而影響反應(yīng)平衡[16]， 同時脂肪酶是一種界面酶， 在水-油界面具有獨特的特性， 在很大程度上其活性依賴于界面面積. 然而， 過量的水使酶的“柔性”變大， 影響酶的催化活力， 同時可能發(fā)生水解副反應(yīng). 表2列出了在對應(yīng)的正辛烷體系中， 不同加水量的條件下生物柴油得率的情況. 可以清楚地看出， 在有機溶劑體系中， 為了維持酶的活性， 一定量的水是必須的. 反應(yīng)得率不僅依賴于溶劑的類型， 而且明顯依賴于加水量. 隨著加水量的增加， 生物柴油得率有所提高. 當(dāng)加水量為10%時， 得率最高； 繼續(xù)增加加水量， 得率開始降低.

表2 在不同的水含量條件下生物柴油得率a

2.3.2 有機溶劑添加量對生物柴油制備的影響

通過試驗， 最適有機溶劑是正辛烷， 加水量為10%. 在這些反應(yīng)條件下， 研究有機溶劑添加量對生物柴油制備的影響， 其最適添加量如圖3所示. 正辛烷添加量為15%時， 生物柴油得率最高. 同時， 數(shù)據(jù)顯示， 在有機溶劑體系中不管選擇甲醇還是乙醇作為底物， 其生物柴油的得率都高于無溶劑體系. 另外， 甲醇作為底物時， 其生物柴油得率(脂肪酸甲酯， FAME)都高于乙醇作為底物時的生物柴油得率(脂肪酸乙酯， FAEE)， 表明甲醇更適合作為酶的底物， 這一結(jié)果和以前報道的結(jié)果相符[17-18]. 因此， 在后面的試驗中選取甲醇作為底物.

圖3 正辛烷加入量對生物柴油得率的影響

a反應(yīng)條件： 將10 wt%的固定化酶加入2.19 g大豆油中， 其中含有20 wt%正辛烷有機溶劑， 醇油摩爾比為4∶1， 甲醇分三次加入， 分別在0， 4 h和8 h加入， 在200 rpm， 40℃的條件下反應(yīng)12 h. 取平均值，±代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD).

2.3.3 醇油比對生物柴油制備的影響

在上述條件下， 研究了醇油比對固定化酶催化制備生物柴油得率的影響， 結(jié)果如圖4所示.

醇在酯交換反應(yīng)中有雙重作用： 一方面， 它作為底物參與反應(yīng). 酯交換反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)， 理論上， 完全轉(zhuǎn)酯化生成脂肪酸甲酯需要3摩爾當(dāng)量的甲醇， 但實際反應(yīng)中過量的甲醇可以促進反應(yīng)向正方向移動， 從而提高生物柴油的得率； 另一方面， 當(dāng)反應(yīng)體系中甲醇過量時， 甲醇對酶表現(xiàn)出毒性作用， 從而抑制酶的催化活力. 對于不同的酶， 其催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)所需的醇油比也不同. 對于固定化酶RML而言， 最適醇油比為5∶1(見圖4).

圖4 醇油比對生物柴油得率的影響

2.3.4 反應(yīng)溫度對生物柴油制備的影響

在上述條件下， 研究了反應(yīng)溫度對固定化酶催化制備生物柴油得率的影響， 如圖5所示. 為了防止脂肪酶的熱失活， 酶催化反應(yīng)通常是在較低的溫度下進行. 另一方面， 提高溫度可以增加分子之間的碰撞頻率， 促使反應(yīng)向吸熱方向移動[19]. 從圖5可以看出， 在50℃時， 獲得最高生物柴油得率， 溫度進一步升高， 其生物柴油得率呈現(xiàn)下降的趨勢.

圖5 溫度對生物柴油得率的影響

2.3.5 固定化酶添加量對生物柴油制備的影響

固定化酶添加量對生物柴油制備的影響結(jié)果如圖6所示. 在制備生物柴油其他條件最優(yōu)的情況下， 加入不同量的固定化脂肪酶. 隨著加酶量的增加， 生物柴油的得率也提高， 固定化酶RML添加量為6%時， 獲得最高生物柴油得率， 加酶量繼續(xù)增加， 生物柴油的得率不僅沒有提高， 反而導(dǎo)致生物柴油得率降低. 這主要是由于過量的加酶量容易使酶團聚， 從而增大傳質(zhì)阻力.

圖6 加酶量對生物柴油得率的影響

2.3.6 固定化酶的操作穩(wěn)定性

酶固定化的目標(biāo)之一是容易回收和再利用. 重復(fù)使用性是評價固定化酶效果的一個重要參考因素. 為了研究固定化酶在生物柴油制備中的重復(fù)使用性， 每一批次反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵回收固定化酶， 再用相應(yīng)的溶劑清洗后投入下一批次新的反應(yīng)液中. 固定化酶RML每一批次的反應(yīng)時間為36 h， 其他反應(yīng)條件不變， 研究了固定化酶的重復(fù)使用性， 結(jié)果如圖7所示. 固定化酶RML在重復(fù)了10個批次之后生物柴油得率為80.5%， 說明固定化酶具有良好的穩(wěn)定性. 在重復(fù)使用過程中， 由于固定化酶活力下降以及脂肪酶的脫落導(dǎo)致生物柴油得率降低. 相比物理吸附， 共價交聯(lián)可以有力地減少酶的脫落. 然而， 由于甲醇和副產(chǎn)物甘油在正辛烷中的低溶解度， 隨著批次的增加， 它們吸附在固定化酶的表面， 增大了傳質(zhì)阻力， 從而導(dǎo)致生物柴油得率的降低.

圖7 固定化酶的重復(fù)利用

3 結(jié)論

本研究通過共價結(jié)合將脂肪酶RML固定于磁性納米復(fù)合材料m-MWCNTs-G3上， 并將固定化酶用于催化大豆油與甲醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油. 實驗結(jié)果表明， 在優(yōu)化條件下， 固定化酶RML對大豆油表現(xiàn)出了良好的催化效果和穩(wěn)定性. 研究結(jié)果有望在其他的領(lǐng)域， 如手性藥物拆分、 不飽和脂肪酸富集等中也有廣泛的應(yīng)用價值.