陳三送，姚 林，王其福，邵雪非，程禮敏

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)外科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 蕪湖 241002)

γ-干擾素誘導(dǎo)的溶酶體硫醇還原酶(lysosomal thiol reductase，GILT)，基因名稱：IFI30，在許多抗原呈遞細(xì)胞如B細(xì)胞、骨髓來源的樹突狀細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞中組成型表達(dá)[1-3]，負(fù)責(zé)催化抗原中二硫鍵的還原。研究發(fā)現(xiàn)GILT在黑色素瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌中差異表達(dá)，影響疾病預(yù)后[4-6]。但其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及其與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系報(bào)道較少。本研究旨在探討GILT在膠質(zhì)瘤中表達(dá)情況及其與膠質(zhì)瘤化療耐藥之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究分析了CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)325例膠質(zhì)瘤患者以及TCGA數(shù)據(jù)庫中非瘤腦組織207例、較低級別膠質(zhì)瘤518例、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤163例中GILT相關(guān)數(shù)據(jù)信息。

1.2 臨床標(biāo)本 選用弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)后獲取的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證GILT的蛋白表達(dá)。其中低級別膠質(zhì)瘤10例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤10例。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選受試者或受試者家屬均簽署知情同意書，同意參與該項(xiàng)目，受試者信息予以嚴(yán)格保密。

1.3 免疫組化檢測 按照免疫組化試劑說明書，先將切片脫蠟、抗原修復(fù)，再用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。血清封閉后，加入一抗4°C孵育過夜。洗滌后，加入二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色后，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片。顯微鏡鏡檢，采集圖像。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：在細(xì)胞漿及細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。光鏡下隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野，記錄染色陽性的百分率。

2 結(jié)果

2.1 GILT在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)且與WHO分級、IDH突變、1 p/19 q聯(lián)合缺失相關(guān) TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示GILT在較低級別膠質(zhì)瘤(LGG)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中表達(dá)均高于非瘤腦組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)分析顯示GILT在WHO Ⅱ～Ⅳ級中隨著腫瘤級別增高，表達(dá)也逐級增高，且在IDH野生型、非1 p/19 q聯(lián)合缺失型中(WHO Ⅱ級除外)表達(dá)分別高于IDH突變型及1 p/19 q聯(lián)合缺失型(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2 GILT在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)與生存期的關(guān)系 CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)分析顯示所有級別膠質(zhì)瘤中不管是原發(fā)還是復(fù)發(fā)患者，GILT高表達(dá)者生存期更短、預(yù)后更差(見圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 免疫組化檢測臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本中GILT蛋白的表達(dá)情況 結(jié)果顯示GILT在低級別及高級別膠質(zhì)瘤中均明顯高表達(dá)(見圖3)，與TCGA、CGGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致。

表1 GILT在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與WHO分級、IDH突變、1 p/19 q聯(lián)合缺失的關(guān)系

A.TCGA數(shù)據(jù)庫中GILT在膠質(zhì)瘤及非瘤腦組織中的相對表達(dá)情況；b.CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)中GILT在WHO Ⅱ～Ⅳ級中的相對表達(dá)情況；c、d.CGGA數(shù)據(jù)庫中GILT在IDH野生型及突變型膠質(zhì)瘤組織中的相對表達(dá)情況；e、f.CGGA數(shù)據(jù)庫中GILT在1 p/19 q聯(lián)合缺失型及非缺失型膠質(zhì)瘤組織中的相對表達(dá)情況。

2.4 GILT表達(dá)與化療耐藥基因之間的關(guān)系 CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)結(jié)果顯示，在原發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者中，GILT的表達(dá)與經(jīng)典的化療耐藥基因MGMT、ERCC1、ERBB2的表達(dá)均成正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

a b

表2 不同GILT表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間對比分析

a、b.低級別膠質(zhì)瘤；c、d.高級別膠質(zhì)瘤。棕黃色示陽性表達(dá)。

表3 GILT與MGMT、ERCC1、ERBB2表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

有研究報(bào)道GILT在抗原提呈及加工過程中起重要作用[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)與黑色素瘤、彌漫性大B淋巴瘤、乳腺癌等預(yù)后相關(guān)[4-6]。然而，其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系，相關(guān)報(bào)道不多。

TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫為膠質(zhì)瘤的研究提供了豐富、可靠的基因組數(shù)據(jù)。筆者通過分析該數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)GILT在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且表達(dá)與WHO分級呈正相關(guān)。其在IDH野生型、非1 p/19 q聯(lián)合缺失型中表達(dá)分別高于IDH突變型及1 p/19 q聯(lián)合缺失型。研究已經(jīng)證實(shí)IDH突變，尤其是IDH1突變顯著影響膠質(zhì)瘤對化療敏感度。IDH1突變型患者化療效果較IDH1野生型好[8-9]。1 p和19 q聯(lián)合缺失是膠質(zhì)瘤，特別是少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤預(yù)后的重要分子指標(biāo)。1 p/19 q聯(lián)合缺失與膠質(zhì)瘤化療敏感度相關(guān)[10]。1 p/19 q聯(lián)合缺失者對含烷化劑的PCV方案及TMZ更敏感，具有較好的預(yù)后[11-12]。然而，本研究中我們發(fā)現(xiàn)GILT在IDH野生型、非1 p/19 q聯(lián)合缺失型中表達(dá)更高。這提示GILT高表達(dá)患者的化療敏感度更差。CGGA數(shù)據(jù)庫中生存分析結(jié)果也佐證了這一結(jié)果。CGGA(mRNAseq_325)數(shù)據(jù)庫生存時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)：不管是原發(fā)還是復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者，GILT高表達(dá)者均具有明顯短的生存時(shí)間。以上結(jié)果表明膠質(zhì)瘤中GILT高表達(dá)與化療敏感度及預(yù)后相關(guān)。

GILT是否也與膠質(zhì)瘤化療耐藥相關(guān)？為此，我們分析了GILT與經(jīng)典的化療耐藥基因MGMT、ERCC1、ERBB2之間的關(guān)系。MGMT屬于一種DNA烷基化損傷修復(fù)酶，通過將O6-甲基鳥嘌呤轉(zhuǎn)移到自身半胱氨酸殘基上，從而抵抗烷化劑的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[13]。ERCC1是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)中一員，主要完成DNA交聯(lián)形成后的切除修復(fù)過程[14]，其主要與氮芥類、順鉑的耐藥相關(guān)[15]。ERBB2編碼的穿膜受體樣蛋白，是上皮生長因子受體家族中的一員，其高表達(dá)與環(huán)磷酰胺、阿霉素、5氟脲嘧啶的耐藥有關(guān)[16-17]。以上3種基因?qū)儆诓煌饔脵C(jī)制的耐藥基因，CGGA數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)均與GILT表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腫瘤化療耐藥基因還有很多，以上3種基因相關(guān)性分析尚不足以說明GILT表達(dá)與膠質(zhì)瘤化療耐藥直接相關(guān)，但提示GILT可能與化療耐藥相關(guān)，可以為進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供線索。

筆者通過臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本同樣證實(shí)了GILT在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析吻合。至于GILT通過何種機(jī)制促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及與耐藥相關(guān)，本課題組正在進(jìn)行下一步研究，希望能為將來膠質(zhì)瘤的治療提供新思路。