孫 甜，呂業(yè)超，鳳羽齡，周萍萍，湛孝東，唐小牛，姜玉新,2

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,浙江 嘉興 314000)

過敏性哮喘是一種長期的慢性氣道炎性疾病[1]。慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等是其主要臨床病理特征[2-3]。氣道上皮細(xì)胞增生引起的氣道阻力增加是導(dǎo)致過敏性哮喘病程加重的主要因素[4]。作為常見的氣傳變應(yīng)原，屋塵螨(house dust mite,HDM)可刺激螨性過敏患者的氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性應(yīng)答、氣道重塑、黏液過度增多，進(jìn)而加重哮喘[5]。

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是一類長度>200 nt的非編碼RNAs，參與包括細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞周期等諸多生理和病理生理過程的調(diào)控[6-9]。研究證實，lncRNAs在氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)病進(jìn)程[10-11]。例如，漿細(xì)胞瘤變異易位1(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)在糖皮質(zhì)激素不敏感的重度哮喘患者中的表達(dá)顯著高于糖皮質(zhì)激素敏感的輕度哮喘患者；抑制PVT1的表達(dá)可促進(jìn)ASMCs增殖，同時抑制IL-6的釋放[12]。RNA00882在血小板源性生長因子處理的胚胎ASMCs中顯著高表達(dá)，抑制其表達(dá)導(dǎo)致胚胎ASMCs增殖下降[13]。BCYRN1通過上調(diào)瞬時受體電位1(transient receptor potential canonical 1,TRPC1)的表達(dá)來促進(jìn)哮喘大鼠ASMCs的增殖和遷移[14]。GAS5通過控制miR-10a/BDNF信號促進(jìn)哮喘ASMCs增殖[15]。此外，TCF7通過靶向TIMMDC1并活化Akt信號促進(jìn)ASMCs增殖[16]。但目前大多數(shù)lncRNAs的功能未知。因此，探討哮喘中l(wèi)ncRNAs對肺上皮細(xì)胞增殖分化的調(diào)控機(jī)制，不僅有利于深入認(rèn)識哮喘的發(fā)病機(jī)制，也有助于為哮喘的免疫治療提供新的實驗證據(jù)。

本研究首先檢測長鏈非編碼RNA 00619(linc00619)的亞細(xì)胞定位；隨后探討了其對BEAS-2B生物學(xué)功能的影響；最后通過基因芯片分析linc00619對BEAS-2B影響的潛在分子機(jī)理，從而為過敏性哮喘的免疫治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞:293T和人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自中科院上海細(xì)胞庫。主要試劑:DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自上海Gibco公司。慢病毒載體pLV6購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。嘌呤霉素購自美國Merck公司。Genomic DNA Extraction kit購自日本Takara公司；Max DNA聚合酶購自南京維諾贊公司。CCK8檢測試劑盒、RIPA裂解液購自上海生工生物。RNeasy mini Kit、RNase-free DNase set購自德國QIAGEN公司。SBC Human(4×180K) lncRNA芯片及配套試劑盒購自美國Agilent公司。FISH TagTMRNA Red Kit購自美國ThermoFisher公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T或BEAS-2B細(xì)胞用DEME培養(yǎng)基(含10%FBS、1.5 mg/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中，于37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 linc00619的亞細(xì)胞定位 按FISH TagTMRNA Red Kit說明書標(biāo)記linc00619探針，并對BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行RNA原位雜交和DAPI復(fù)染。

1.2.3 linc00619雙突變載體的制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)linc00619(Gene ID：414260)核苷酸序列，設(shè)計3對雙導(dǎo)引RNAs(dgRNA)，即dgRNA1：CAT TAG AGG ACC GGA CAT GGT GG(+)和AAT AAA TCT GGA CCT ACA CAT GG(-)；dgRNA2：CTT GCT TCT GAC GAA AGC TCA GG(+)和AGC CTA CAA TTC TAA GTA TTT GG(-)；dgRNA3：CTC CAT TCC TGT GTT TAG GCA GG(+)和ATC TCG ATT CAA GTT TGT TGA GG(-)，分別產(chǎn)生791、700和300 bp突變體。將它們分別插入慢病毒pLV6中。

將BEAS-2B細(xì)胞(2.5×105細(xì)胞/孔)鋪于24孔板，加入0.5 mL含10% FBS的DMEM于37℃、5%CO2過夜；棄去培養(yǎng)液，加入0.5 mL稀釋后的不同病毒液37℃、5%CO2培養(yǎng)12～24 h；棄去培養(yǎng)液并加入0.5 mL DMEM+10% FBS，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h；熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.2.4 linc00619突變體的鑒定 用Genomic DNA Extraction kit提取BEAS-2B基因組DNA，PCR擴(kuò)增用下列引物：正向5′-ACA GCT TGC TTG GCA CTG AAA TG-3′和反向5′-AAC CAT CCC CTA CCA TCA TCC AT-3′。PCR體系(50 μL)：25 μL 2× Max buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol/L)、各2 μL正/反向引物(10 μmol/L)、200 ng基因組DNA、2.5 U Max DNA聚合酶、17 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95℃變性3 min， 95℃ 5s、60℃ 15s、72℃ 40s循環(huán)42次，72℃ 5s，終延伸16℃ 1 min。

1.2.5 熒光定量PCR 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(10 μL)：RNA模板1 μg，引物(50 pmol/L)1 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，補充ddH2O至10 μL。65℃ 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物迅速置于冰上，加入2×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶100 U，ddH2O 5.5 μL?；靹蚝?2℃ 60 min，75℃ 15 min，4℃保持。PCR反應(yīng)(20 μL)：2×PCR Master Mix 10 μL，正/反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板1 μL，補充ddH2O至20 μL。定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.2.6 細(xì)胞增殖試驗 將100 μL linc00619敲除的BEAS-2B細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)鋪于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，根據(jù)CCK8試劑盒說明書加入CCK8試劑，避光37℃、5%CO2孵育2 h；用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測光密度值。

1.2.7 細(xì)胞遷移試驗 向Transwell小室上層無血清DMEM培養(yǎng)液(含0.2% BSA)中加入linc00619敲除的BEAS-2B細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)，下層培養(yǎng)液為含10% FBS的DMEM，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用DAPI染色，熒光顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)。

1.2.8 Western blot 用PBS洗滌linc00619敲除的BEAS-2B細(xì)胞，加入100 μL/孔的RIPA細(xì)胞裂解液，4℃ 30 min，12 000 r/min 10 min收集上清，12.5% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)到PVDF膜，膜用1%的BSA 37℃封閉1 h后，加入鼠抗人p-AKT、AKT、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK及β-actin一抗(1∶1000稀釋)37℃孵育1 h，1×TBST緩沖液洗膜3次，5分鐘/次。加HRP標(biāo)記的驢抗鼠IgG二抗(1∶1000稀釋)，37℃孵育1 h，1×TBST緩沖液洗膜3次，5分鐘/次。加化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光。

1.2.9 芯片雜交、數(shù)據(jù)提取和分析 用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，用NucleoSpin RNA Clean-up XS kit和RNase-Free DNase Set純化。按照Agilent表達(dá)譜芯片套裝試劑盒操作說明擴(kuò)增總RNA和熒光標(biāo)記，并用RNeasy mini kit純化。將1.65 μg標(biāo)記的cRNA用Gene Expression Hybridization Kit與芯片在65°C雜交17 h。Gene Expression Wash Buffer Kit清洗芯片后，用Agilent Microarray Scanner掃描芯片，F(xiàn)eature Extraction software 12.0讀取數(shù)據(jù)，limma軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 linc00619定位于細(xì)胞質(zhì) 用熒光標(biāo)記的linc00619探針對BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)inc00619 RNA原位雜交及DAPI復(fù)染結(jié)果顯示，linc00619 RNA分布于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。

2.2 linc00619敲除的鑒定 基因組PCR結(jié)果顯示，dgRNA1和dgRNA3均產(chǎn)生預(yù)期大小的突變體，并用于后續(xù)研究。定量PCR結(jié)果表明，與對照組相比(1.006 3±0.116 6)，dgRNA1～3均可抑制linc00619的表達(dá)，抑制效率分別0.001 1±0.000 2、0.000 3±0.000 1和0.004 6±0.000 7(P<0.01)(圖2B)。但dgRNA2未檢測到突變體(圖2A)，且其抑制linc00619表達(dá)的機(jī)制有待闡明。

圖1 linc00619定位于BEAS-2B細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(400×)

A.PCR擴(kuò)增基因組DNA中l(wèi)inc00619突變體；B.熒光定量PCR分析linc00619敲除BEAS-2B細(xì)胞中l(wèi)inc00619表達(dá)(n=3，F(xiàn)=222.556，P=0.000；多組間兩兩比較，**P<0.01)。

2.3 linc00619敲除促進(jìn)了BEAS-2B增殖和細(xì)胞遷移 CCK8結(jié)果表明，與對照組相比，dgRNA1介導(dǎo)linc00619敲除24 h促進(jìn)了BEAS-2B的增殖(P<0.01)，但dgRNA3對BEAS-2B的增殖影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；dgRNA1和dgRNA3介導(dǎo)linc00619敲除48 h均促進(jìn)了BEAS-2B的增殖(P<0.05)，但和dgRNA1相比，dgRNA1的促進(jìn)更明顯且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。dgRNA1介導(dǎo)linc00619敲除72 h促進(jìn)了BEAS-2B的增殖(P<0.01)，而dgRNA3抑制了BEAS-2B的增殖(P<0.01)。見表1。遷移結(jié)果顯示，相比于對照組(215±8)，dgRNA1(376±17)和dgRNA3(317±12)介導(dǎo)linc00619敲除均促進(jìn)BEAS-2B的遷移(P<0.01)(圖3)。

表1 linc00619敲除對BEAS-2B細(xì)胞增殖的影響

A．BEAS-2B細(xì)胞遷移的代表性圖片(200×)；B.計數(shù)并比較A中遷移的BEAS-2B細(xì)胞(n=3，F(xiàn)=120.139，P=0.000；多組間兩兩比較，**P<0.01)。

2.4 linc00619敲除對mRNA表達(dá)譜的影響 為探討linc00619影響B(tài)EAS-2B細(xì)胞的潛在分子機(jī)理，我們用lncRNA芯片分析linc00619敲除的差異表達(dá)mRNAs，并進(jìn)行KEGG信號富集。結(jié)果顯示，共獲得3 461個差異mRNAs(│差異倍數(shù)│>2)，其中1 298個上調(diào)，2 163個下調(diào)(圖4A)。有922個基因在KEGG信號通路被富集，圖4B列出前30個信號通路，包括MAPK信號。本研究檢測了增殖相關(guān)分子AKT、MEK和ERK的表達(dá)。結(jié)果表明，linc00619敲除活化了AKT和ERK [AKT：與對照組(0.57±0.11)相比，dgRNA1(1.29±0.05)和dgRNA3(1.18±0.14)升高(P<0.01)；ERK：與對照組(0.82±0.13)相比，dgRNA1(2.44±0.05)和dgRNA3(1.38±0.03)升高(P<0.01)]。

A.差異表達(dá)mRNAs的散點圖;B.差異表達(dá)mRNAs的KEGG信號通路富集的排名前30的信號通路;C.Western blot分析AKT、MEK和ERK蛋白表達(dá);D～F.對C中AKT、MEK和ERK蛋白的灰度分析(n=3，F(xiàn)AKT=39.588，PAKT=0.000；FMEK=2.389，PMEK=0.173；FERK=300.118，PERK=0.000。多組間兩兩比較，** P<0.01)。

3 討論

本研究首先檢測到linc00619位于細(xì)胞質(zhì)。隨后發(fā)現(xiàn)linc00619敲除促進(jìn)了BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移。芯片結(jié)果表明linc00619敲除導(dǎo)致MAPK信號顯著富集。Western blot結(jié)果顯示AKT和ERK被顯著活化。這些結(jié)果表明，linc00619可能通過AKT/ERK信號參與了BEAS-2B細(xì)胞的生物學(xué)功能。

lncRNAs的亞細(xì)胞定位決定了其功能。細(xì)胞核lncRNAs可能參與包括染色質(zhì)重塑和修飾及核小體等功能[17]；而細(xì)胞質(zhì)lncRNAs主要參與包括mRNA周轉(zhuǎn)、mRNA修飾等[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)linc00619位于細(xì)胞質(zhì)，提示其可能參與了轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，其詳細(xì)機(jī)理有待闡明。

lncRNAs在哮喘中也發(fā)揮重要作用。如Hu等用基因芯片篩選并獲得了224個TGFβ處理的BEAS-2B中差異表達(dá)lncRNAs[20]。Li等發(fā)現(xiàn)，LncRNA-ENST00000501520可促進(jìn)惡性BEAS-2B細(xì)胞的增殖[21]。此外，BEAS-2B中l(wèi)ncRNAuc001.dgp.1可增強PM2.5誘導(dǎo)的肺部炎癥[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，linc00619敲除促進(jìn)了BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移。Gao等也發(fā)現(xiàn)，lncRNA-DQ786227沉默抑制了惡性BEAS-2B細(xì)胞的增殖[23]。為清晰linc00619在BEAS-2B中的作用機(jī)理，我們用lncRNAs芯片篩選并獲得了3 461個linc00619敲除的差異表達(dá)mRNAs。其中有922個基因被富集到KEGG信號通路，包括MAPK信號。Western blot證實，linc00619敲除活化了AKT和ERK。但其詳細(xì)機(jī)理有待闡明。

綜上所述，本研究表明，linc00619位于細(xì)胞質(zhì)，敲除該分子導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移增加，以及AKT和ERK的活化。但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。