王懷禹

（南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 南充 637131）

人們受牛精液冷凍技術(shù)的啟發(fā)，從20世紀(jì)60年代開始了豬精液冷凍的制作研究，近年來，其受到全球養(yǎng)豬業(yè)的高度重視和廣泛關(guān)注，世界范圍的研究者為其開展了大量的工作，取得了一定的成效。我國從20世紀(jì)50年代初期就開始了對豬精液冷凍技術(shù)的探究，但由于缺乏持續(xù)性，研究進(jìn)展不大，但近幾年，像溫氏集團(tuán)、百鈞達(dá)科技發(fā)展（北京）有限公司及中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位都在積極進(jìn)行豬冷凍精液的研究，取得了不錯的效果?？傮w來看，豬精液冷凍技術(shù)的研究雖然走過了近70年的探索歷程，對其工藝流程也進(jìn)行了不斷優(yōu)化，鑒于豬精子有區(qū)別于牛羊精子的生理特性，精子在冷凍和解凍過程中更易受到損傷，致使母豬繁殖成績不理想，導(dǎo)致目前凍精的使用仍沒有得到大范圍推廣。但這并不妨礙人們探索豬精液冷凍技術(shù)的步伐，豬精液冷凍所帶來的諸多益處及廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景也非常值得研究者繼續(xù)為之做出努力，豬精液冷凍工藝流程中任何一個環(huán)節(jié)所能取得的進(jìn)展，都可為今后豬冷凍精液標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 豬精液冷凍技術(shù)操作流程

豬精液冷凍制作的劑型主要有顆粒凍精、0.25/0.5/5 mL規(guī)格細(xì)管凍精以及5 mL扁平塑料袋凍精幾種。目前，國內(nèi)豬精液冷凍工藝流程基本相同（如圖1）。

2 豬精液冷凍關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)研究及應(yīng)用

2.1 精液采集與品質(zhì)鑒定

優(yōu)質(zhì)的精液是制作冷凍精液的基礎(chǔ)和前提，因此，除需要保證公豬良好的飼養(yǎng)管理條件外，對公豬精液的采集是尤為重要的。個別規(guī)?；i場采用了自動采精系統(tǒng)，但仍有相當(dāng)部分豬場采用的是傳統(tǒng)的手握法采精，這就要求工作人員必須按照規(guī)范的程序?qū)嵤┎删Ｖ饕⒁獠灰廴揪?，精液中的膠狀物質(zhì)要棄去，只收集豬射精中間部分的精液。精液品質(zhì)鑒定遵循先外觀后微觀的操作步驟，即先觀察精液的顏色、氣味、采精量幾個方面是否正常，然后再在顯微鏡下觀察精子的活率、密度、畸形率及頂體異常率是否在正常范圍內(nèi)（如表1）。

2.2 稀釋液成分的優(yōu)化

精液稀釋液既可以擴(kuò)大精液的容量，又可以保護(hù)稀釋后的精子，因此，優(yōu)質(zhì)的精液稀釋液是提高凍精質(zhì)量的重要一環(huán)。豬精液凍精稀釋液的主要成分見表2。豬冷凍精液稀釋液成分的優(yōu)化一直是精液冷凍研究的熱點，主要集中在營養(yǎng)劑、抗凍劑和抗氧化劑的研究上。

2.2.1 營養(yǎng)劑

由于精子只能進(jìn)行分解代謝，需要在其稀釋液中添加一些六碳糖作為營養(yǎng)劑，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖等，以補充精子能量耗損。可見在豬精液稀釋液中補充糖類非常重要，研究發(fā)現(xiàn)，以果糖效果最好。但在實際生產(chǎn)中，考慮到果糖價格較貴，多用蔗糖或葡萄糖作替代。研究表明，在豬凍精稀釋液中加入低濃度的六碳糖能取得較好的保存效果，過高濃度反而對精子頂體有害。Yi 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，如果加入可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖（0.05%）于豬凍精稀釋液中，解凍后的精子頂體完整率和活率有顯著提高。Paulenz 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加果糖和蔗糖的效果反而不及乳糖好。李青旺等[3]研究表明，在豬凍精稀釋液中添加復(fù)合多糖（乳糖+2%～3%的葡萄糖）的效果較好。潘紅梅等[4]也研究了不同濃度的雙糖混合液對豬凍精保存效果的影響，發(fā)現(xiàn)乳糖（33.3%）+蔗糖（66.7%）組合對豬凍精保存的效果是最好的。

2.2.2 抗凍劑

精液在快速冷凍過程中，為避免或減輕冰晶造成的機(jī)械性物理性損傷，需要在稀釋液中添加甘油、二甲基亞砜（DMSO）及三羥甲基氨基甲烷（Tris）等抗凍物質(zhì)。劉晉津等[5]研究發(fā)現(xiàn)，4% 甘油濃度冷凍后精子活率為0.483±0.698，達(dá)到最佳狀態(tài)。二甲基亞砜就是一種毒性極低的抗凍劑，可以克服甘油濃度較高時對精子的滲透毒性影響。馬麗等[6]研究表明，用二甲基亞砜完全替代甘油的凍精解凍后，添加6%二甲基亞砜試驗組的精液品質(zhì)質(zhì)量有明顯提升，分別達(dá)到：精子活率26%、精子畸形率16%、質(zhì)膜完整率49%及頂體完整率51%，均明顯優(yōu)于其他二甲基亞砜添加組（P<0.05）和對照組，也優(yōu)于30 mL/L甘油組，且最佳添加劑量為60 mL/L；同時，750 mL/L甘油與250 mL/L二甲基亞砜混合凍精解凍后的活率優(yōu)于只添加二甲基亞砜組的效果，且畸形率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率優(yōu)于30 mL/L甘油對照組。除了單一研究某種抗凍物質(zhì)對豬精液冷凍保存的作用效果外，2種及多種混合抗凍物質(zhì)對精液冷凍保存效果的探索也一直沒有中斷過。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺等氨基酸可發(fā)揮類似甘油保護(hù)劑的功能，但又不可能徹底取代甘油，需要通過與卵黃、甘油等結(jié)合使用才能產(chǎn)生保護(hù)作用[7]。張樹山等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在雞卵黃低密度脂蛋白（9%）冷凍稀釋液中添加40 mmol/L的谷氨酰胺對冷凍豬精子直線向前運動速度、精子活率、頂體完整率和質(zhì)膜的完整性均達(dá)到最佳，優(yōu)于對照組（P<0.05）。

表1 公豬精液品質(zhì)評價項目參考值

表2 豬精液凍精稀釋液主要成分

2.2.3 抗氧化劑

豬精液冷凍過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），有賴于添加外源性的抗氧化劑進(jìn)行消除，以維持精子細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu)不被破壞。有研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的維生素C或維生素E能夠提高精子活率，保持解凍后精子頂體結(jié)構(gòu)的完整性[9,10]。黃俻華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，豬精液冷凍稀釋液中如果加入維生素C或維生素E的濃度較高時，精子頂體、質(zhì)膜的完整性、線粒體的活性以及解凍后精子的存活時間將會得到顯著提高。事實表明，600 μg/mL 的維生素C或維生素E，是顯著提高陸川豬精液冷凍保存效果的最佳添加劑量，解凍后精子的活力和畸形率都顯著優(yōu)于對照組（P<0.05）。Gadea等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍稀釋液中添加適量還原GSH可以增強精子核蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保持其受精能力，解凍后精子質(zhì)量獲得整體性的提高。張斌等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豬精液冷凍稀釋液中添加5 mmol / L 的GSH和900 μg/ mL的HA能明顯增強豬精液冷凍效果。Varo-Ghiuru等[14]研究發(fā)現(xiàn)，豬凍精稀釋液中保持適當(dāng)濃度的葉黃素有助于維持精子結(jié)構(gòu)的完整，增強解凍后精子對滲透壓的耐受性，提高精子活率。王捷等[15]研究結(jié)果表明，天然抗氧化劑芝麻酚（3，4－亞甲二氧基苯酚，sesamol，SM）非常利于豬精子的冷凍保存，0.2 g/L芝麻酚為保持精子結(jié)構(gòu)完整性的最佳添加劑量，其解凍后豬精子活率和抗氧化能力得到顯著提高（P<0.05）。孫艷青等[16]研究發(fā)現(xiàn)，新型高效抗氧化劑—葡萄籽原花青素（葡萄籽提取物）對冷凍—解凍后的豬精子抗氧化具有保護(hù)作用，其抗氧化能力大大超過維生素C和維生素E。結(jié)果顯示，40 μg/mL的葡萄籽原花青素是最佳添加劑量，精液冷凍保存效果均優(yōu)于其他對照組。有的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖、淫羊藿多糖等均具有較強的免疫活性和抗氧化活性，紅景天多糖的最佳添加劑量為6 mg/mL，淫羊藿多糖的最佳添加量為4 mg/mL，可顯著提高解凍后精子的活率、質(zhì)膜及頂體完整率[17，18]。

2.3 豬精液冷凍各環(huán)節(jié)溫度的調(diào)控

豬精子對溫度最為敏感，而豬精液冷凍過程中幾乎每一個環(huán)節(jié)都涉及到溫度（如表3），只有嚴(yán)格按照各環(huán)節(jié)所要求的溫度條件下實施操作，才不會使精子發(fā)生冷休克以及形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的改變，確保凍精質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。

2.4 精液冷凍生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制

豬精液冷凍技術(shù)受到豬品種、稀釋液的組成、滲透壓、糖、冷凍保護(hù)劑、添加物凍前處理、冷凍保存承載工具、冷凍解凍程序等眾多因素的影響。大量研究表明，豬精液冷凍解凍后效果不盡一致，也驗證了豬冷凍精液質(zhì)量容易出現(xiàn)波動，質(zhì)量不穩(wěn)定。精液冷凍過程中任何一個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)上的不規(guī)范或操作失誤均可導(dǎo)致凍精質(zhì)量下降或制作失敗。以冷凍保存承載工具及冷凍過程對精液冷凍保存效果的影響為例，薛琦[19]研究發(fā)現(xiàn)，即使都是細(xì)管凍精，但它們解凍后精子的活率存在差異，0.5 mL細(xì)管凍精好于0.25 mL細(xì)管凍精；距離液氮面的距離也會影響凍精解凍后精子的活率，距離液氮面較近的凍精，解凍后的活率優(yōu)于距離液氮距離較遠(yuǎn)的。因此，為確保豬精液凍后質(zhì)量始終處于穩(wěn)定與可控狀態(tài)，對生產(chǎn)工藝流程的每一個環(huán)節(jié)與每一個步驟，均應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化作業(yè)程序執(zhí)行，不定期對精液質(zhì)量性狀進(jìn)行評估和追溯分析，對存在的問題及時進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化，為豬冷凍精液技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)提供經(jīng)驗積累，也為今后實施養(yǎng)豬標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)奠定堅實基礎(chǔ)。

3 問題與展望

雖然豬精液冷凍技術(shù)的研究與應(yīng)用取得了一定成效，但從全球范圍看，豬冷凍精液配種還不到0.5%，說明豬精液冷凍保存技術(shù)仍有很多問題需要解決。如缺乏冷凍保存各工藝流程制作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范以及缺乏一套完整的、科學(xué)的冷凍與保存體系等。盡管如此，由于中國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)所占的市場份額決定了人們會不斷探索和改進(jìn)豬精液冷凍技術(shù)存在的諸多關(guān)鍵性技術(shù)難題，對豬冷凍精液技術(shù)的研究和推廣只會更加深入。百鈞達(dá)公司在豬精液冷凍技術(shù)方面已經(jīng)取得突破，能夠使解凍的凍精達(dá)到76%～85%的活率，讓我們看到了勝利的曙光?？梢灶A(yù)言，豬冷凍精液取代鮮精配種是大勢所趨，豬凍精的商業(yè)化應(yīng)用指日可待。

表3 豬精液冷凍工藝流程溫度要求