任永超

摘要：為了提高當(dāng)歸及其混偽品的分子鑒定結(jié)果的可靠性，研究了一種當(dāng)歸及其混偽品的分子鑒定技術(shù)。先對當(dāng)歸材料及其混偽品的trn L-F序列和ropC1序列進(jìn)行了基因序列擴(kuò)增和測序，引入DNA條形碼鑒定技術(shù)，鑒定當(dāng)歸及其混偽品的分子，最后通過trn L-F序列有效區(qū)分出了所有的當(dāng)歸及其混偽品的分子，而rpoC1序列僅能區(qū)分部分當(dāng)歸和其混偽品。

關(guān)鍵詞：分子鑒定技術(shù)；當(dāng)歸；混偽品；遺傳信息；基因序列

引言

當(dāng)歸屬于傘形科類植物，味道比較甘甜，稍帶辣味且性暖，對于人體來說具有補血活血、調(diào)理經(jīng)絡(luò)、止疼以及通便之功效。在臨床上通常將當(dāng)歸用于血虛血瘀、眩暈心悸，治理女性的月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)痛經(jīng)、虛寒腹痛以及風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病，對于皮外傷、癰痛以及腸燥便秘等病狀也具有顯著療效。

到目前為止，當(dāng)歸藥材的鑒定方法主要有基原、性狀、顯微、理化、生物等。但是這些鑒定方法都對相關(guān)的鑒定人員有著較高的經(jīng)驗要求，且具有主觀性強(qiáng)、通用性差等明顯缺陷，不利于當(dāng)歸藥材鑒定方法的標(biāo)準(zhǔn)化建立、發(fā)展以及大力推廣。近年來，伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，將遺傳物質(zhì)DNA鑒定方法應(yīng)用到當(dāng)歸藥材的鑒定方法中去已經(jīng)成為當(dāng)今的主流研究方向。當(dāng)歸藥材中的基因信息直接通過DNA在藥材分子間傳遞，且在同一個生物體內(nèi)，每一種藥材細(xì)胞都包含著相同的遺傳信息，在遺傳上具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，不會輕易因外界因素的影響而發(fā)生變化。DNA分子鑒定技術(shù)為當(dāng)歸藥材鑒定問題的解決提供了客觀、快速、有效的依據(jù)，因此本文主要研究了一種當(dāng)歸及其混偽品的分子鑒定技術(shù)。

當(dāng)歸及其混偽品的分子鑒定

利用NCBI的BLAST相似性，對當(dāng)歸及其混偽品的trn-L-F序列和rpoC1序列進(jìn)行搜索，如果兩個序列都可以被搜索到，說明trn-L-F序列和rpoC1序列具有很好的匹配度，將其看作是目標(biāo)序列。用megav.5.0化學(xué)成分分析軟件計算trn-L-F序列和rpoC1序列在當(dāng)歸及其混偽品中的組成情況以及平均G+C含量（%），并計算出每一種分子序列的堿基變異數(shù)、信息位點、相同堿基數(shù)量以及轉(zhuǎn)換/轉(zhuǎn)化等信息。

作為一種新的物種鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)可以通過分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來顯示植物體內(nèi)基因序列的具體信息，并直觀準(zhǔn)確地作出判斷，彌補了傳統(tǒng)鑒定方法的不足。DNA條形碼鑒定方法不僅可以明確物種之間的差異，還可以明確較小物種內(nèi)部的差異。DNA片段要盡可能短，才能方便DNA序列提取和PCR序列擴(kuò)增，因此一般引物設(shè)計要高度保守。

通過由trn-L-F序列構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹可以將當(dāng)歸藥品聚類為一個分支，并對聚類結(jié)果進(jìn)行分析，從而確定所有相關(guān)物種在一個分枝上都能聚集成一個具有高度親和力的物種群，也就是理論上利用trn-L-F序列可以構(gòu)建一個當(dāng)歸識別數(shù)據(jù)庫，從而識別當(dāng)歸及其混偽品之間的區(qū)別。接下來的工作中，只需放大trn-L-F序列，并與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，即可確定鑒定結(jié)果的真實性。但由rpoC1序列構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹不能很好地區(qū)分各屬的關(guān)系，所以trn-L-F序列更適合于當(dāng)歸及其混偽品的鑒定。但是該序列鑒定功能不強(qiáng)，可作為輔助鑒定工具，并與其他基因結(jié)合進(jìn)行鑒定。該規(guī)律說明，trn-L-F基因?qū)Ξ?dāng)歸品種的種間鑒別優(yōu)于rpoC1基因，能夠完全區(qū)分真假當(dāng)歸，具有較高的應(yīng)用價值。

用葉綠體基因組片段trn L-F序列擴(kuò)增當(dāng)歸及其混偽品發(fā)現(xiàn)，SNP的21位特異性鑒定位點為當(dāng)歸。有9個堿基A在273-284處連續(xù)重復(fù)，但片段中的堿基A重復(fù)次數(shù)不同，或含有其他堿基，因此也可根據(jù)此區(qū)分當(dāng)歸及其偽混品。另外，在trn-L-F序列基礎(chǔ)上構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹表明，純當(dāng)歸本身具有與其他摻假物明顯不同的擴(kuò)展性。但是在不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品上trn-L-F和rpoC1這兩個序列并沒有很大差別。由trn-L-F和rpoC1序列構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹表明，目前市場上三種商品當(dāng)歸藥材與正品當(dāng)歸相差甚遠(yuǎn)，證明這三種原料都是假藥，應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

結(jié)束語

本文主要研究了當(dāng)歸及其混偽品的分子鑒定技術(shù)，在分子鑒定方面，利用trn-L-F序列能有效地區(qū)分當(dāng)歸、混偽品與近緣種，而rpoC1序列只能區(qū)分部分當(dāng)歸、混偽品與近緣種，而部分明確區(qū)分白芷、阿壩當(dāng)歸等樣品，且鑒定效率低下，這為當(dāng)歸市場中提供了一種快速有效的鑒定方法，對當(dāng)歸產(chǎn)品DNA條碼的補充和完善具有重要意義。

基金項目：

貴州省2017年度黔南州社會發(fā)展科技計劃項目“黔南地區(qū)當(dāng)歸道地性相關(guān)的遺傳信息研究”（編號：黔南科合社字（2017）1號）