張鶯臍 張羨宇 石 碩 劉佩武 張 倩 劉 鷹 郭 睿

(1. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023; 2. 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連海洋大學(xué)，大連 116023)

氟苯尼考(Florfenicol, FFC)是近些年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用最為廣泛的抗生素藥物之一, 因其可用于治療多種魚類的細(xì)菌性疾病, 如腸敗血癥、脊柱病、癤病和鏈球菌敗血癥等[1], 且具有抗菌活性高、無潛在致再生障礙性貧血等優(yōu)點(diǎn),作為氯霉素禁用后的主要替代藥物, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要作用[2]。據(jù)調(diào)查, 2013年我國抗菌藥物的總用量高達(dá)8.4×107kg, 其中氟苯尼考使用量將近1×107kg,列居所有獸用抗菌藥物用量的前列[3]。Zong等[4]在2007年對(duì)大連養(yǎng)殖場(chǎng)周邊海域的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn),氟苯尼考?xì)埩袅窟_(dá)34.9—11000 μg/L。氟苯尼考理化性質(zhì)穩(wěn)定, 在生物體內(nèi)不能被完全代謝[5], 經(jīng)污水處理廠處理也不能被完全降解[3,6], 殘留的抗生素經(jīng)多種途徑不斷的被匯入到水環(huán)境介質(zhì)中, 造成了抗生素及抗生素降解物“假持久性”存在的現(xiàn)象[7],使得非靶標(biāo)水生生物遭到長期慢性暴露。有研究表明, 水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的四種抗菌藥(多拉菌素、甲硝唑、氟苯尼考、土霉素)對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)中的非靶標(biāo)生物, 如海洋費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischer)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、浮萍(Lemna minor)及水蚤(Daphnia)等均具有顯著的毒性作用[8]。

海洋微藻是海洋水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者, 可以通過光合作用為水體中軟體動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和魚類等水生生物提供氧氣和食物, 其種類的多樣性及初級(jí)生產(chǎn)量直接影響整個(gè)水生系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[9,10]。球等鞭金藻(Isochrysis galbana)具有無細(xì)胞壁、體積小、繁殖快、營養(yǎng)豐富, 以及易被貝類幼蟲捕捉和消化吸收等特點(diǎn), 常被用作海洋經(jīng)濟(jì)雙殼類動(dòng)物幼蟲優(yōu)良的開口餌料[11]。此外, 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)富含多糖及多種重要的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)[12], 是類胡蘿卜素等活性物質(zhì)的潛在來源[13], 也可作為化石燃料的生物替代品。同時(shí), 球等鞭金藻易于培養(yǎng),是進(jìn)行水生生態(tài)毒理學(xué)研究的理想模式生物。

為探究水環(huán)境中抗生素殘留對(duì)非靶標(biāo)生物的影響, 本文以球等鞭金藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 研究環(huán)境相關(guān)濃度水平的氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻生長和光合作用的影響, 并通過比較細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素和脂肪酸含量的變化探究氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞的急性毒性作用機(jī)理。本研究將探究對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素殘留的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn), 以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

球等鞭金藻藻種來自大連玉洋集團(tuán), 經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后作為試驗(yàn)材料。氟苯尼考粉(純度為≥98%, 山東亞康藥業(yè)有限公司), 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(CAS 73231-34-2, 純度≥99%)和乙酸銨(NH4Ac)購自Sigma-Aldrich, 色譜級(jí)甲醇和乙腈購自禹王集團(tuán)。玻璃纖維過濾膜(GF/F, 47 mm)、固相萃取柱(Oasis MAX, 1 cc, 30 mg)購自Waters。實(shí)驗(yàn)過程中所用器具在使用前, 于121℃滅菌鍋中高溫滅菌。

1.2 藻類培養(yǎng)及生長抑制

使用100 mL f/2培養(yǎng)基于錐形瓶中培養(yǎng)球等鞭金藻, f/2培養(yǎng)基主要包括: NaNO3、NaH2PO4、微量元素(ZnSO4·4H2O、MnCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeC6H5O7·5H2O、Na2MoO4和Na2EDTA,純水配置)和維生素溶液[VB1、VB12和VH(生物素)]。培養(yǎng)基與滅菌海水按1﹕1000比例添加配置。

球等鞭金藻接種于150 mL錐形瓶, 培養(yǎng)體積為100 mL, 瓶口使用無菌透氣封口膜以防污染, 置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 培養(yǎng)周期72h, 光照強(qiáng)度6500 lx, 光暗比12L﹕12D, 每天定時(shí)搖瓶3次。每天取出3 mL藻液, 使用分光光度計(jì)(GENESYS 10S,Thermo)于680 nm處檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液光密度,并以培養(yǎng)基作為參比確定藻液密度。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞生物量, 繪制生物量-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=14162X–0.0783,R2=0.999), 藻細(xì)胞生物量與光密度之間具有較好的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)選取的氟苯尼考暴露濃度為0、0.001、0.01、0.1、1.0、10、20和50 mg/L, 其中包括已在養(yǎng)殖尾水中檢測(cè)到的殘留濃度(0.001 mg/L)[13], 及實(shí)際養(yǎng)殖過程中投喂?jié)舛?10 mg/L), 每組設(shè)置三個(gè)平行。根據(jù)OD680計(jì)算抑制藻細(xì)胞生長的EC50值(半最大效應(yīng)濃度)。

1.3 細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考含量的檢測(cè)

細(xì)胞中氟苯尼考濃度的檢測(cè)方法參照Song等[5]的研究, 使用高效液相色譜儀(HPLC, SPD-20A, 島津)檢測(cè)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考的含量。

前處理方法: 利用玻璃纖維濾膜收集50 mL經(jīng)氟苯尼考暴露72h的藻液(106cells/mL), 使用培養(yǎng)基沖洗濾膜后, 將濾膜置于15 mL離心管中, 加入5 mL色譜級(jí)甲醇, 渦旋2min, 超聲30min后, 利用細(xì)胞超聲破碎儀(800 w, 5min)進(jìn)行細(xì)胞破碎。經(jīng)4500 r/min離心10min, 收集上清液。重復(fù)上述步驟, 合并上清液。將上清液置于溫和的氮?dú)饬飨? 于40℃下濃縮液體至1 mL, 加入超純水至5 mL, 使用固相萃取柱進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行濃縮純化。固相萃取柱事先由4 mL 0.1%氨水甲醇、4 mL甲醇和4 mL超純水進(jìn)行活化后過樣, 之后加入4 mL鉬酸銨(25 mmol/L,pH 4, 色譜級(jí))進(jìn)行淋洗, 使用1 mL甲醇和1 mL 0.1%氨水甲醇洗脫。取1 mL樣品裝入樣品瓶, 上機(jī)待測(cè)。甲醇和水、乙腈和水是檢測(cè)氟苯尼考時(shí)最為常用的流動(dòng)相組合[14,15], 通過對(duì)流動(dòng)相及流動(dòng)相比例的改變, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為甲醇﹕水(v﹕v)=50﹕50時(shí), 峰型較好, 適用于檢測(cè)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考的濃度。

檢測(cè)條件: 流動(dòng)相為甲醇﹕水= 50﹕50(v﹕v), 液相色譜柱采用Thermo Hypersil GOLD色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 柱溫40℃, 檢測(cè)波長為223 nm, 進(jìn)樣流速為1 mL/min, 進(jìn)樣量為20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制: 稱取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品0.0010 g,使用甲醇(色譜級(jí))溶解并定容至100 mL, 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為10 mg/L, 于–4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｉ蠙C(jī)檢測(cè)前使用甲醇稀釋成濃度為0.01、0.1、1、5、10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。HPLC檢測(cè)程序同上, 以峰面積為縱坐標(biāo), 氟苯尼考濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4 光合色素含量的測(cè)定

球等鞭金藻細(xì)胞中光合色素濃度的檢測(cè)方法參照Xiong等[16]的研究。不同濃度氟苯尼考暴露72h后, 收集10 mL藻液, 通過離心去上清(4500×g,10min, 4℃)獲得藻細(xì)胞團(tuán), 用于檢測(cè)藻細(xì)胞中葉綠素和類胡蘿卜素的含量。使用飽和碳酸鎂配置的90%丙酮溶液重懸細(xì)胞團(tuán), 以消除葉綠素酶干擾。在60℃黑暗條件下孵育30min后, 再次離心(4500×g,10min, 4℃)。取上清液于分光光度計(jì)在波長為665、652及470 nm處檢測(cè)吸光值, 并根據(jù)以下公式對(duì)光合色素的濃度進(jìn)行計(jì)算:

1.5 脂肪酸含量檢測(cè)

藻粉的制備: 離心(4500 r/min, 5min)100 mL氟苯尼考暴露72h的藻液, 收集細(xì)胞團(tuán), 加入20 mL預(yù)冷的0.5 mol/L碳酸氫氨溶液去除藻細(xì)胞表面鹽分。再次離心(4500 r/min, 10min, 4℃)去上清, 收集藻細(xì)胞。使用冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-10N, 新芝)冷凍干燥24h, 恢復(fù)至室溫后, 使用瑪瑙研缽研磨, 制備藻粉。–20℃密封保存, 待用。

樣品前處理: 稱取藻粉4 mg, 加入30 μL十七烷酸甘油三酯(Glyceryl triheptadecanoate, CAS 2438-40-6, 3.04 mg/mL, Sigma), 加入5 mL 2%硫酸甲醇進(jìn)行預(yù)處理。將樣品置于磁力攪拌器上, 在600 r/min、70℃下進(jìn)行1h油浴, 對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化[17]。靜置, 待恢復(fù)至室溫, 加入0.75 mL超純水, 2 mL正己烷, 渦旋混勻后, 將樣品倒入裝有適量無水硫酸鈉的離心管中, 4500 r/min離心2min去除水分, 將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入1.5 mL進(jìn)樣瓶, 上機(jī)檢測(cè)。

檢測(cè)條件: 使用氣相色譜儀(7890A GC System,Agilent Technologies, USA)對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè)。初始溫度為210℃, 進(jìn)樣口的溫度為250℃, 檢測(cè)器的溫度為280℃。載氣為高純度N2和H2, 流速分別為20 和30 mL/min, 空氣流速為400 mL/min。自動(dòng)進(jìn)樣針清洗劑為正己烷, 進(jìn)樣前后各清洗3次, 進(jìn)樣量為1 μL。通過與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比, 鑒別各脂肪酸組分, 以面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸組分的相對(duì)百分含量[18]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Origin Pro軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行分析, 事后檢驗(yàn)采用Duncan方法或Dunnett’s C test對(duì)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。當(dāng)P<0.05時(shí), 被認(rèn)為具有顯著性差異, 當(dāng)P<0.01時(shí), 被認(rèn)為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻生長的影響

如圖 1所示, 當(dāng)氟苯尼考濃度低于1 mg/L時(shí), 對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)作用, 當(dāng)濃度為10—50 mg/L時(shí), 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻的生長產(chǎn)生了顯著的抑制作用, 且隨著氟苯尼考濃度的增加和暴露時(shí)間的延長, 抑制作用也明顯增加。20和50 mg/L氟苯尼考暴露組, 對(duì)球等鞭金藻存在顯著抑制作用(P<0.05), 抑制率分別為53%和83%。通過研究發(fā)現(xiàn), 各濃度組(除50 mg/L濃度組)在暴露24h時(shí), 對(duì)球等鞭金藻產(chǎn)生的抑制作用無明顯差異,隨著暴露時(shí)間的增加, 對(duì)球等鞭金藻生長的抑制作用逐漸增大, 72h時(shí)10、20 mg/L濃度組與對(duì)照組相比具有顯著的抑制作用(P<0.05)。

圖 1 氟苯尼考暴露對(duì)球等鞭金藻生長的影響Fig. 1 The effects of florfenicol on the growth of Isochrysis galbana at the different exposure duration

采用Origin Pro軟件非線性曲線擬合(NLFit)中的Growth/Sigmidal擬合工具對(duì)氟苯尼考暴露濃度和球等鞭金藻生長抑制率進(jìn)行非線性擬合, 得到擬合模型的相關(guān)參數(shù)。擬合后效應(yīng)曲線如圖 2所示, 計(jì)算得出, 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻72h-EC50為17.12 mg/L。

2.2 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考的積累

根據(jù)優(yōu)化的前處理方法和液相色譜分析條件進(jìn)行分析, 氟苯尼考保留時(shí)間為4.2min, 如圖 3所示, 色譜峰與氟苯尼考濃度間具有良好的線性關(guān)系(Y=48844:2X?4796:54R2=0.99), 根據(jù)線性公式計(jì)算球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考的蓄積濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在各濃度組暴露72h后, 藻細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考的積累量隨著暴露濃度的增加而增加, 在低濃度氟苯尼考(0.001、0.01和0.1 mg/L)暴露下, 并未檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考積累現(xiàn)象。在1、10、20、50 mg/L的氟苯尼考暴露72h后, 藻細(xì)胞內(nèi)氟苯尼考積累濃度分別為5.2、11、65.4和122 μg/mL。

2.3 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)光合色素含量的影響

圖 2 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻生長抑制率的影響Fig. 2 The effects of florfenicol on the growth inhibition ratio of Isochrysis galbana

圖 3 球等鞭金藻中氟苯尼考的色譜圖Fig. 3 The chromatogram map of florfenicol in Isochrysis galbana

根據(jù)氟苯尼考暴露對(duì)球等鞭金藻生長的結(jié)果,選擇0、0.1、1、10和20 mg/L濃度作為后續(xù)試驗(yàn)濃度, 其中包括EC50-72h值, 保持其他培養(yǎng)條件不變。如圖 4所示, 在氟苯尼考暴露72h后, 與對(duì)照組相比, 低濃度組(0.1、1 mg/L)中總?cè)~綠素含量沒有顯著性差異, 10和20 mg/L濃度組總?cè)~綠素含量分別顯著降低19%和22.5%(P<0.01)。藻細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素含量的變化趨勢(shì)則與葉綠素含量變化趨勢(shì)相反, 與對(duì)照組相比較, 1、10和20 mg/L暴露組細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素濃度均出現(xiàn)較為明顯的上升趨勢(shì),1 mg/L濃度組中細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素含量極顯著增加13%(P<0.01), 而10和20 mg/L 氟苯尼考暴露組顯著增加26%和28%(P<0.05)。

2.4 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量的影響

圖 4 氟苯尼考暴露對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Fig. 4 The effects of florfenicol on the chlorophyll and carotenoid of Isochrysis galbana

如表 1所示, 在試驗(yàn)條件下, 暴露濃度對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成及含量具有明顯影響。在0.1和1 mg/L濃度組中藻細(xì)胞的總脂肪酸(Total Saturated Fatty Acids TFA)含量分別為(8.64±0.26)和(8.23±0.25) mg/mg, 與對(duì)照組相比呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)。在10和20 mg/L濃度組中, 藻細(xì)胞脂肪酸含量分別為(9.23±0.53)和(9.46±0.21) mg/mg, 與對(duì)照組沒有顯著性差異。球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)飽和脂肪酸(Saturated fatty acid SFA)及單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid MUFA)含量均無明顯的變化趨勢(shì), 僅在暴露濃度為1 mg/L時(shí), 存在明顯降低的現(xiàn)象。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids PUFA)是一類長鏈的多不飽和脂肪酸, 主要包括α-亞麻酸(C18﹕3, LNA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)[19]。相對(duì)于對(duì)照組, 1、10和20 mg/L濃度組的藻細(xì)胞中PUFA含量有明顯的增加趨勢(shì),而DHA、EPA含量無明顯的變化。通過本研究發(fā)現(xiàn), 在高濃度(20 mg/L)氟苯尼考的暴露下, 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的多不飽和脂肪酸含量均出現(xiàn)較為明顯增加的現(xiàn)象。

3 討論

3.1 氟苯尼考暴露對(duì)球等鞭金藻生長的影響

目前, 環(huán)境中抗生素殘留問題已經(jīng)引起公眾的廣泛關(guān)注, 抗生素對(duì)微藻的急性毒性相關(guān)研究已取得了一定的進(jìn)展, 但大部分研究集中于抗生素對(duì)淡水微藻的毒性作用的探究上[20—24], 而關(guān)于抗生素對(duì)于海水微藻的毒性作用機(jī)理的研究相對(duì)較少。氟苯尼考因其良好的藥效學(xué)特征和相對(duì)較低的毒性而大量應(yīng)用于魚類細(xì)菌性疾病的治療中[25]。然而,抗生素在環(huán)境中的殘留會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生不同程度的影響。Liu等[26]的研究發(fā)現(xiàn), 氟苯尼考濃度低于2 mg/L時(shí), 可促進(jìn)中肋骨條藻(Skeletonema costatum)生長, 而濃度高于2 mg/L時(shí), 氟苯尼考抑制其生長。然而, 在Ferreira等[27]的研究中發(fā)現(xiàn), 土霉素和氟苯尼考對(duì)扁藻(Tetraselmis chuii)的抑制濃度分別為5.3和6 mg/L。本研究中, 50 mg/L濃度組在暴露24h時(shí)顯示出顯著的抑制現(xiàn)象, 隨著暴露時(shí)間延長不存在恢復(fù)現(xiàn)象, 10和20 mg/L濃度組在暴露48h后開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象, 10 mg/L組對(duì)球等鞭金藻生長的抑制作用低于20 mg/L組。本研究結(jié)果與Lai等[28]研究結(jié)果相似, 當(dāng)氟苯尼考濃度大于10 mg/L時(shí)對(duì)球等鞭金藻的生長具有一定的抑制作用。在低濃度的抗生素的作用下對(duì)藻類的生長起到一定的生長促進(jìn)作用[29], 當(dāng)氟苯尼考暴露濃度小于等于1 mg/L對(duì)球等鞭金藻的生長有一定的促進(jìn)作用。環(huán)境中低濃度抗生素持久性存在的現(xiàn)象, 可能會(huì)引起水體中浮游植物的大量生長, 如東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosaScherffel)和尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)等赤潮藻, 對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響[30, 31]。

3.2 氟苯尼考暴露對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)光合色素合成的影響

光合作用是藻類重要的生理生化活動(dòng), 可將太陽能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能, 葉綠素在光合作用和光合反應(yīng)中起著重要的作用[32]。在環(huán)境脅迫下, 葉綠素含量的降低會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)光合反應(yīng)中心捕獲光的能力,進(jìn)而影響藻細(xì)胞內(nèi)的光合活性。有研究表明[33], 水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)在氟苯尼考和甲砜霉素(> 1 μg/L)暴露1—7d后, 其葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm結(jié)果與葉綠素a含量的變化趨勢(shì)相似。本研究發(fā)現(xiàn)隨著氟苯尼考暴露濃度的不斷增加, 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)總?cè)~綠素濃度呈下降趨勢(shì), 當(dāng)暴露濃度達(dá)到10 mg/L時(shí), 出現(xiàn)顯著的抑制現(xiàn)象。造成該結(jié)果的原因可能有以下幾種: (1)藻細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)[34];(2)藻細(xì)胞中積累過量活性氧(ROS)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞, 進(jìn)而影響葉綠素的合成[26]; (3)在抗生素的脅迫作用下, 導(dǎo)致藻細(xì)胞類囊體脂質(zhì)過氧化, 影響電子鏈的傳遞, 進(jìn)而影響藻類光合效率[35]。光合作用作為衡量藻類生長狀態(tài)的主要指標(biāo)[36], 通過比較本研究中藻類的生長與葉綠素含量的變化趨勢(shì),提示氟苯尼考暴露可能會(huì)抑制球等鞭金藻的光合效率, 影響葉綠素合成, 進(jìn)而影響球等鞭金藻的生長。

在環(huán)境脅迫下, 藻細(xì)胞損傷主要是通過氧化壓力形成的[37]。類胡蘿卜是細(xì)胞內(nèi)主要的光保護(hù)色素, 可吸收葉綠體中剩余能量, 避免產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的單一氧分子, 避免膜體損傷, 從而起到光保護(hù)作用[38]。本研究發(fā)現(xiàn), 隨著氟苯尼考暴露濃度的增加, 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的類胡蘿卜素含量逐漸增加, 這與其他研究結(jié)果相一致[39,40]。類胡蘿卜素根據(jù)其作用可分為初級(jí)類胡蘿卜素和次級(jí)類胡蘿卜素。初級(jí)類胡蘿卜素為補(bǔ)充色素, 與光合作用密切相關(guān)。而次生胡蘿卜素, 如蝦青素等, 是由某些微藻在高脅迫狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生的, 不參與光合作用, 而是聚集在細(xì)胞脂質(zhì)中, 抑制活性氧的生成, 進(jìn)而保護(hù)葉綠體避免受損。此外, 類胡蘿卜素色素有高抗氧化的特性,可以保護(hù)微藻免受自由基攻擊, 穩(wěn)定細(xì)胞代謝功能[41,42]。在低濃度氟苯尼考(<1 mg/L)的作用下, 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的類胡蘿卜素變化趨勢(shì)不明顯, 可能此時(shí)的類胡蘿卜素主要為初級(jí)類胡蘿卜素。而在高濃度氟苯尼考(>1 mg/L)的暴露下, 藻細(xì)胞受到抗生素的嚴(yán)重脅迫, 誘導(dǎo)藻細(xì)胞中次生胡蘿卜素生成, 起保護(hù)作用。由于藻細(xì)胞在高濃度氟苯尼考(20 mg/L)的暴露下會(huì)積累大量的活性氧, 可能會(huì)對(duì)藻細(xì)胞光合系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激性損傷, 進(jìn)而破壞細(xì)胞代謝功能, 紊亂其生長[43]。

表 1 不同濃度氟苯尼考暴露對(duì)球等鞭金藻脂肪酸(FAME)組成的影響Tab. 1 The effect of florfenicol on the fame composition in I. galbana (%)

3.3 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量對(duì)氟苯尼考暴露的響應(yīng)

球等鞭金藻具有獨(dú)特的脂肪酸組成, 其富含營養(yǎng)價(jià)值較高的DHA和EPA, 是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料生物[44]。有研究表明, 在蝦幼體、海水魚幼體及軟體動(dòng)物幼體時(shí)期投喂球等鞭金藻, 可顯著提高水生物的生長和存活率[45]。通過本研究發(fā)現(xiàn), 在氟苯尼考的暴露下, 球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA、EPA的含量無明顯的變化現(xiàn)象。但在0.1和1 mg/L濃度下,藻細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸含量較對(duì)照組有明顯下降的現(xiàn)象, 這可能與球等鞭金藻累積脂肪酸的特點(diǎn)有關(guān),即生物量與總脂肪酸含量是呈極顯著性負(fù)相關(guān)的[46],當(dāng)生物量升高時(shí), 總脂肪酸含量呈下降趨勢(shì), 此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸多用于細(xì)胞的生長分裂。暴露濃度高于1 mg/L時(shí), 球等鞭金藻在抗生素的脅迫下,會(huì)將脂類作為首選的儲(chǔ)能化合物, 脂肪酸含量增加從而幫助細(xì)胞抵抗外界脅迫, 減少細(xì)胞死亡[47]。

氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻的72h-EC50值為17.12 mg/L, 依據(jù)國家環(huán)保保護(hù)局的新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估準(zhǔn)則—生態(tài)毒理學(xué)危害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[48], 確定氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻的危害等級(jí)為中級(jí), 經(jīng)過72h的氟苯尼考暴露, 球等鞭金藻生長、光合色素、脂肪酸等生理指標(biāo)均受到影響。這表明在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的使用, 可能會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生一定的危害作用。隨著暴露濃度的增加, 抗生素在細(xì)胞內(nèi)存在富集的現(xiàn)象, 這可能會(huì)導(dǎo)致水體中殘留的抗生素隨著食物鏈的傳遞而進(jìn)入水生生物體內(nèi), 影響其生長發(fā)育?，F(xiàn)有的研究多為抗生素對(duì)微藻類急性毒性實(shí)驗(yàn), 鮮少有環(huán)境中殘留的抗生素及其分解產(chǎn)物對(duì)水生動(dòng)植物長期暴露的相關(guān)研究。因此, 有必要進(jìn)一步探究環(huán)境中抗生素長期存在對(duì)水生生物的影響。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以球等鞭金藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 研究環(huán)境濃度氟苯尼考暴露72h后對(duì)球等鞭金藻生長的影響,探討氟苯尼考對(duì)海洋微藻的作用機(jī)理, 得到以下結(jié)論: (1) 氟苯尼考在低濃度時(shí)(≤1 mg/L)可以促進(jìn)球等鞭金藻的生長, 而在高濃度(1 mg/L)時(shí), 對(duì)球等鞭金藻表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用, 氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻72h-EC50值為17.12 mg/L, 符合中級(jí)毒性標(biāo)準(zhǔn)范圍。(2)氟苯尼考暴露(10 mg/L)會(huì)顯著降低球等鞭金藻的總?cè)~綠素含量, 抑制葉綠素合成, 干擾球等鞭金藻正常的光合作用過程。(3)氟苯尼考暴露誘導(dǎo)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素和脂肪酸參與抵抗脅迫損傷。