嚴(yán)海璘,朱宗財,張王斌,杜培秀,張超,趙文軍,李為民*

1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300; 2.塔里木大學(xué)，南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081; 4.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176

梨火疫病(fire blight)是一種毀滅性的植物病害，主要危害仁果類果樹和薔薇科植物。該病害自19世紀(jì)末首次發(fā)現(xiàn)于美國，現(xiàn)已蔓延至歐洲、北非、大洋洲和亞洲等50多個國家，嚴(yán)重威脅全球蘋果和梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。梨火疫病的病原為梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)，是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，隸屬于腸桿菌科歐文氏菌屬。因其危害嚴(yán)重，梨火疫病菌名列全球十大植物病原細(xì)菌之一[3]，在許多國家和地區(qū)被列為重要的檢疫性病原[4]。梨火疫病菌一般通過自然孔口和傷口作為感染途徑，首先侵入樹木皮層薄壁組織的細(xì)胞間隙，在后期進(jìn)入木質(zhì)部導(dǎo)管，并能在植物體內(nèi)快速遷移；感病植株最初癥狀表現(xiàn)為水浸狀，隨后出現(xiàn)萎蔫和壞死，受感染的部位變成棕色或黑色，類似火燒一樣，最終導(dǎo)致整棵樹的死亡[5-6]。

病原菌分泌的致病相關(guān)蛋白也稱為效應(yīng)因子，在與宿主植物互作過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。在革蘭氏陰性菌中，III型分泌系統(tǒng)、IV型分泌系統(tǒng)、Sec依賴分泌途徑和雙精氨酸移位酶途徑(Tat途徑)是效應(yīng)因子輸出的主要通道[9]。其中，Sec分泌途徑包括由3種跨膜蛋白SecY、SecE和SecG組裝的SecYEG通道，在外周膜ATP酶SecA的協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)包括毒力因子在內(nèi)的各種蛋白；此外，Sec途徑還包含SecD、SecF和YajC，由這3種膜蛋白參與調(diào)控蛋白質(zhì)的高效輸出[10-11]。Sec分泌蛋白在細(xì)胞質(zhì)中以未折疊前蛋白的形式存在，氨基末端為信號肽(signal peptide, SP)，指導(dǎo)前體蛋白經(jīng)由Sec系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)。在革蘭氏陰性菌中，前體蛋白跨越細(xì)胞內(nèi)膜，轉(zhuǎn)移至周質(zhì)，由胞外信號肽酶I(LepB)或脂蛋白信號肽酶II(LspA)切割SP，并折疊為成熟蛋白；成熟蛋白或者停留在周質(zhì)中，或者轉(zhuǎn)移到次級分泌途徑，如V型分泌系統(tǒng)(type V secretion system,T5SS)、脂蛋白(Lol)途徑或Ⅱ型分泌系統(tǒng)(typeⅡsecretion system,T2SS)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)為外膜或胞外蛋白[7-8,11]。

植物病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶是一類重要的致病因子[12-14]。細(xì)胞壁降解酶包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、木聚糖酶等，在病原菌消解植物抗侵染機(jī)械屏障、入侵寄主等方面發(fā)揮著重要作用。纖維素酶是與致病相關(guān)的主要酶類之一[15-18]，已知許多黃單胞菌屬(Xanthomonas)、歐文氏菌屬、青枯菌屬(Ralstonia)的植物病原細(xì)菌，以及絲核菌屬(Rhizoctonia)、稻瘟菌屬(Magnaporthe)的植物病原真菌均分泌纖維素酶[19-22]，以此協(xié)助病原自身的入侵與擴(kuò)散。

迄今為止，關(guān)于梨火疫病菌是否編碼具有分泌特征的纖維素酶類尚不清楚。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合大腸桿菌(Escherichiacoli)堿性磷酸酯酶(phosphatase, PhoA)檢測體系，從梨火疫病菌全基因組序列中篩選出2種依賴Sec途徑分泌的纖維素酶EAMY_3602(GenBank：FN434113.1)和EAMY_1236(GenBank：FN434113.1)，并對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)分析，以期發(fā)現(xiàn)梨火疫病菌的毒力因子，為梨火疫病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨火疫菌株DSM17948由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存，pET-30a質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)所用試劑盒均購自TaRaKa、TIANGEN、全式金公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 分泌蛋白信號肽的生物信息學(xué)分析基于SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[23]、Lipopversion 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)[24]和Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)[25]完成；Sec依賴分泌蛋白中纖維素酶的篩選參照梨火疫病菌CFBP1430編碼蛋白的功能注釋[26]。

1.2.2基因克隆 根據(jù)梨火疫病菌CFBP1430 (GenBank：FN434113.1)、EAMY_3602和EAMY_1236編碼基因(分別命名為Ea3602和Ea1236)的核酸序列，設(shè)計兩對引物3602-F/3602-R和1236-F/1236-R(引物序列見表1)。利用CTAB法提取梨火疫菌株DSM 17948的基因組DNA，以此為模板，利用上述引物分別擴(kuò)增Ea3602和Ea1236，PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化均參照嚴(yán)海璘等[27]的方法進(jìn)行。

1.2.3PhoA檢測 基于大腸桿菌的PhoA檢測體系由本研究室構(gòu)建[28]。設(shè)計兩對引物3602SP-F/3602SP-R和1236SP-F/1236SP-R(引物序列見表1)，分別以pMD-Ea3602和pMD-Ea1236質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增Ea3602和Ea1236基因的信號肽編碼序列，長度分別為42和60 bp，mphoA載體構(gòu)建和檢測均參照嚴(yán)海璘等[27]的方法進(jìn)行。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.4接種梨幼果 梨幼果接種參照嚴(yán)海璘等[27]的方法進(jìn)行。接種后分別在0、8、24 h取樣，用無菌刀片刮取大約0.8 g的剖面組織，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5總RNA提取與RT-qPCR分析 提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以梨火疫菌recA(GenBank: FN434113.1)為內(nèi)參基因[29]，利用引物3602-qF/3602-qR、1236-qF/1236-qR(引物序列見表1)分別進(jìn)行Ea3602和Ea1236基因表達(dá)的qPCR分析。具體參照TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)說明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT(Livak)方法計算相對表達(dá)量，ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組，顯著性差異分析采用Student’st-test[30]，P<0.05和P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選梨火疫病菌Sec依賴分泌纖維素酶

前期研究表明，梨火疫病菌CFBP1430編碼3 393個蛋白，其中168個蛋白N末端為SPs，推測其可能通過Sec系統(tǒng)分泌[31]。參照CFBP1430編碼蛋白的功能注釋[26]，我們從168種Sec依賴分泌蛋白中進(jìn)一步篩選出2種具有纖維素酶功能的蛋白：EAMY_3602和EAMY_1236，其中前者為內(nèi)切葡聚糖酶，后者為β-葡萄糖苷酶。目前，已有CFBP1430[26]、ATCC49946[32]和E-2[33]共3個梨火疫病菌菌株完成了全基因組序列測定。Blast分析表明EAMY_3602和EAMY_1236在所有3個菌株中的同源性均為100%。利用SignalP 4.1、Lipopversion 1.0和Phobius分析進(jìn)一步證實(shí)EAMY_3602和EAMY_1236 N末端為信號肽序列，且均由信號肽酶LepB切割，切割位點(diǎn)分別位于第14個和20個氨基酸(表2)。

2.2 克隆Ea3602和Ea1236基因

以梨火疫菌株DSM17948的基因組DNA為模板，利用3602-F/3602-R和1236-F/1236-R擴(kuò)增EAMY_3602和EAMY_1236的編碼基因，分別獲得975和2 298 bp的PCR產(chǎn)物(圖1)，與預(yù)期結(jié)果大小一致。將目的片段回收、連接，測序結(jié)果確證所擴(kuò)增片段為Ea3602和Ea1236。

2.3 驗(yàn)證EAMY_3602和EAMY_1236的分泌特性

為了驗(yàn)證EAMY_3602和EAMY_1236的分泌特性，我們分別將EAMY_3602和EAMY_1236信號肽(3602SP和1236SP)的編碼序列插入pET-mphoA，與mphoA融合，構(gòu)建pET-3602SP-mphoA和pET-1236SP-mphoA(圖2A)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21細(xì)胞。PhoA檢測結(jié)果顯示：含有pET-3602SP-mphoA或pET-1236SP-mphoA轉(zhuǎn)化子在指示培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，呈現(xiàn)藍(lán)色，與陽性對照(含有pET-phoA的BL21細(xì)胞)結(jié)果相似，而陰性對照(帶有pET-mphoA的BL21細(xì)胞)仍保持白色(圖2B)。這一結(jié)果表明3602SP和1236SP能夠引導(dǎo)mphoA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到周質(zhì)，由此證實(shí)EAMY_3602和EAMY_1236可通過梨火疫病菌的Sec途徑進(jìn)行分泌。

表2 梨火疫病菌Sec依賴分泌纖維素酶Table 2 The putative Sec-dependent secreted cellulase identified from E. amylovora

M—DL 5 000 Marker; 1—Ea3602 的PCR產(chǎn)物；2—Ea1236的PCR產(chǎn)物圖1 Ea3602和Ea1236基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR product of Ea3602 and Ea1236 gene

2.4 Ea3602和Ea1236在梨火疫病菌侵染幼梨過程中的表達(dá)分析

為了揭示Ea3602和Ea1236在病原菌侵染過程中的潛在功能，我們用梨火疫病菌接種酥梨幼果，分別在接種后0、8、24 h提取總RNA，利用RT-qPCR分析這兩種纖維素酶編碼基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：Ea3602在8和24 h的表達(dá)量逐漸降低，但與0 h相比無顯著差異(圖3)；相反，Ea1236在8和24 h的表達(dá)量逐步提高，分別較0 h提高2.43和3.26倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。由此推測β-葡萄糖苷酶EAMY_1236可能是梨火疫病菌的毒力因子，在侵染寄主植物過程中發(fā)揮重要作用，而內(nèi)切葡聚糖酶EAMY_3602則與梨火疫病菌侵染無明顯關(guān)聯(lián)。

A：PhoA檢測體系的載體示意圖；B：信號肽3602SP和1236SP引導(dǎo)mphoA分泌圖2 利用phoA體系檢測EAMY_3602和EAMY_1236的信號肽Fig.2 The signal peptides of EAMY_3602 and EAMY_1236 were detected by phoA system

注：**—與同組0 h相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。圖3 Ea3602和Ea1236基因在梨火疫病菌侵染過程中的表達(dá)分析Fig.3 Analysis on the expression of Ea3602 gene and Ea1236 gene in the process of infection of E. amylovora

3 討論

在細(xì)菌中，大約20%～30%的編碼蛋白定位于胞質(zhì)外，蛋白的胞質(zhì)外轉(zhuǎn)運(yùn)對于維持細(xì)菌生存至關(guān)重要[9,34]。Sec分泌途徑在細(xì)菌中廣泛存在，是蛋白胞質(zhì)外轉(zhuǎn)運(yùn)主要的跨膜運(yùn)輸系統(tǒng)[35]，包括毒力因子在內(nèi)的很多蛋白均通過Sec途徑分泌到胞質(zhì)外環(huán)境中[10-11]。關(guān)于梨火疫病的研究已有百余年歷史，目前已明確胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)能夠保護(hù)梨火疫病菌有效躲避植物防御系統(tǒng)，以及在干旱條件下免受水分和營養(yǎng)損失[36-38]；此外發(fā)現(xiàn)DspA/E、HrpN、Eop1和AvrRpt2EA等III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, T3SS)分泌蛋白對于病原菌入侵及其在寄主植物中定殖同樣具有重要作用[39-41]。最新研究顯示,梨火疫病菌可能利用Sec途徑分泌蛋白酶介導(dǎo)病原侵染[31]。本研究利用生物信息學(xué)分析結(jié)合PhoA檢測體系，從梨火疫病菌Sec分泌蛋白中篩選鑒定出2個纖維素酶：EAMY_3602和EAMY_1236。已有研究表明許多植物病原細(xì)菌和病原真菌分泌的纖維素酶是其完全毒力發(fā)揮所必需的[19-21]；同時，纖維素酶也是激發(fā)植物防御反應(yīng)的有效誘導(dǎo)物，例如，用纖維素酶處理甜椒葉片，能夠誘導(dǎo)水楊酸水平顯著增加[42]。

纖維素酶根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和作用方式，可分為外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[43-44]。參照梨火疫病菌編碼蛋白的功能注釋[26]，本研究篩選的兩個纖維素酶EAMY_3602和EAMY_1236分別為內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。關(guān)于病原菌內(nèi)切葡聚糖酶已有大量研究，如：水稻黃單胞菌(X.oryzaepv.oryzae)、菊歐文氏菌(E.chrysanthemi)、柑橘黃單胞菌亞種(X.citrisubsp.citri)的內(nèi)切葡聚糖酶均為其重要毒力因子，參與病原菌的致病過程[21,45-46]。但是，本研究發(fā)現(xiàn)梨火疫病菌在侵染幼梨時，Ea3602的mRNA表達(dá)量沒有顯著變化，因而推測Sec分泌內(nèi)切葡聚糖酶EAMY_3602可能與梨火疫病菌侵染無密切關(guān)聯(lián)。與之相反，Ea1236基因在病原侵染過程中mRNA表達(dá)量顯著提高，暗示β-葡萄糖苷酶EAMY_1236可能是梨火疫病菌潛在的毒力因子。但根據(jù)早期報道，梨火疫病菌在致病過程中沒有造成寄主植物細(xì)胞壁多糖的降解[47]，暗示纖維素酶沒有參與該病原對寄主的侵染；此外，另有文獻(xiàn)指出在梨火疫病菌中表達(dá)大腸桿菌β-葡萄糖苷酶，對其毒力沒有顯著影響[48]。因此，我們在后續(xù)研究中將制備Ea1236基因的敲除突變體，確證EAMY_1236是否參與病原侵染以及在不同時空維度的作用，以期揭示梨火疫病菌致病的新機(jī)制。