劉宏亮,丁倩雯,TSEGAY Teame,郝強,王安然,馬德銘,冉超,楊雅麟,張震*,周志剛*

1.中國農業(yè)科學院飼料研究所水產動物飼料創(chuàng)新團隊，北京 100081；2.北京大學信息科學技術學院量子電子學研究所，北京 100871

在水產營養(yǎng)和飼料研究中，選擇合適的檢測指標對有效地評定營養(yǎng)素的作用和指導配合飼料的生產尤為重要。形體指標的檢測是魚類常規(guī)營養(yǎng)評定的重要組成部分，包括含肉率、臟體比、脂體比等。含肉率是衡量魚類生產性能的重要指標之一，受魚的種類、生活環(huán)境、餌料等影響[1]；脂體比檢測具有重要現(xiàn)實意義，由于蛋白質原料的缺乏，水產養(yǎng)殖中高脂飼料的應用越來越普遍，造成魚體脂肪組織過量蓄積及魚類營養(yǎng)性疾病頻發(fā)[2]，其中魚類脂肪組織主要是指腹腔脂肪組織[3-4]；臟體比能夠反映魚類營養(yǎng)狀態(tài)。目前，魚類營養(yǎng)研究中，魚類含肉率的檢測是測定魚體重后，去除鰓、鰭、骨板、內臟和骨骼等非肉質部分，稱量各部分重量，計算出魚體肌肉占體重的百分比[1]；脂體比的檢測是測定魚體重后解剖取腹腔脂肪組織稱重，計算出脂肪組織占體重的百分比[5]；臟體比是解剖魚體稱量內臟，計算出內臟占體重的百分比?？梢钥闯?，形體指標的常規(guī)測定需要解剖魚體，會造成樣品損失，而且耗時耗力。因此，建立無損快速檢測技術來定量分析各組織含量是魚類營養(yǎng)評定中的重要需求。

低場核磁共振技術具有快速、無損的特點[6]。樣品中處于不同能態(tài)的氫質子比例符合玻爾茲曼平衡，對樣品施加射頻脈沖后，低能態(tài)氫質子向高能態(tài)躍遷，停止脈沖射頻后，氫質子回到基態(tài)恢復玻爾茲曼平衡，這個過程所需要的時間被稱為馳豫時間[7-8]，包括縱向弛豫時間(T1)和橫向弛豫時間(T2)[9]。1H低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)快速無損檢測技術，已被廣泛應用于食品、高分子、石油、醫(yī)藥等領域的工業(yè)質量控制中，用于測定各種材料的固液比和油水比，如含油巖石、食品乳劑和植物種子等[10]。弛豫時間分布實驗包括簡單、快速的一維實驗以及更為復雜的多維實驗。一維實驗使用脈沖之間的恒定間隔，允許評估縱向或橫向弛豫；而在多維實驗中，信號是作為2個或多個自變量的函數測量的，允許自旋系統(tǒng)在不同弛豫機制下演化[11]。常用的一維工具是基于90°脈沖后自由感應衰減信號的采集，如脈沖序列自旋回波、脈沖場梯度自旋回波、自旋回波、反演/飽和恢復[12]。有研究人員提出了新的二維(two-dimension，2D)弛豫時間分布脈沖序列，包括T1-T2[11]、T2-store-T2[13]和T2-D[14]。其中，低場核磁共振T1-T2譜技術已被應用于油菜籽成分分析[12]和巖石含油分析[15]。

近年來，核磁共振分析逐漸被應用于水產相關研究中，如利用低場核磁共振技術分析水產品干燥過程中的水分含量[16]、研究水產品蛋白質變性[17]、預測水產品理化指標[18-19]以及檢測水產動物脂肪體積[3-4,20]。由此可知，核磁共振分析主要被應用于水產品加工的相關研究中，在水產動物營養(yǎng)相關研究中的應用較少，而且多是基于一維核磁技術和核磁成像技術，利用低場核磁共振T1-T2二維譜技術對魚類組織進行定性及定量分析尚未見報道?；诖?，本研究以羅非魚為實驗對象，探究利用低場核磁共振T1-T2譜技術對羅非魚組織進行定性和定量分析的可行性。首先，利用低場核磁共振T1-T2譜技術對羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織進行定性分析；然后采用組織混合模擬活體，進一步驗證各組織信號能否實現(xiàn)分離鑒定；隨后對能夠實現(xiàn)分離的組織信號建立定量分析的模型，并驗證其可靠性，以期推進利用低場核磁共振T1-T2譜技術確定組織含量的快速無損技術在魚類營養(yǎng)代謝研究中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚購自北京超市發(fā)超市。

SPEC-RE1-3D型核磁共振分析儀(北京斯派克科技發(fā)展有限公司)，相關參數為：磁場強度：0.5 T；氫質子共振頻率：21 MHz；磁體溫度：37 ℃；樣品測試區(qū)域：20 mm×20 mm(高×直徑)圓柱。

1.2 實驗方法

1.2.1低場核磁共振T1-T2譜技術檢測的一般步驟 將水模標準樣置入試管后插入核磁共振探頭中，在核磁共振2D(nuclear magnetic resonance 2D，NMR 2D)掃描軟件上選擇氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)脈沖序列，點擊頻率搜索功能，獲取設備氫核共振頻率，繼續(xù)點擊脈沖寬度搜索功能，獲取90°及180°激勵脈沖的寬度。隨后，取出水模標準樣，將待測樣品放入核磁試管并置于核磁共振探頭中，在NMR 2D掃描軟件中選擇T1-T2脈沖序列，設置飽和恢復時間最小值(TIMin)為100 μs，飽和恢復時間最大值(TIMax)為2 000 000 μs，以TIMin至TIMax對數分布31個不同的飽和恢復時間點，檢測各飽和恢復時間點的回波串信號。儀器主要測試參數如下：90°脈沖寬度15 μs；180°脈沖寬度30 μs；探頭穩(wěn)定時間10 μs；濾波器穩(wěn)定時間10 μs；回波間隔300 μs；磁場主頻19.42 MHz；濾波器帶寬10 000 Hz；采樣間隔4 μs；回波采樣點數1；采集回波個數4 096；掃描次數8。

數據采集結束后使用T1T2Inv反演軟件對采集的信號進行T1-T2二維譜分析，獲取被測樣品的T1弛豫時間、T2弛豫時間以及T1/T2比值。T1-T2二維譜中橫坐標為T2弛豫時間，縱坐標為T1弛豫時間，以不同顏色表示核磁共振信號幅度值(無因次)。

1.2.2羅非魚掃描檢測 ①組織定性：將羅非魚(2 kg)麻醉后，取羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織和腸道組織，去除其他組織殘留，根據1.2.1中操作步驟分別對肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織進行定性分析；

②定性分離驗證：將①中的4種組織混合模擬活體，根據1.2.1中步驟進行操作，驗證利用低場核磁T1-T2譜技術分離組織的可靠性；

③組織標準曲線制作：根據②的結果，將可分離組織取梯度重量，進行掃描反演分析，計算各梯度對應信號強度，制作“梯度重量-信號強度”標準曲線；

④活體應用：羅非魚(初始體重0.6±0.05 g)養(yǎng)殖2周(循環(huán)水養(yǎng)殖，每天投喂2次羅非魚商品飼料，每頓投喂量為初始體重3%)，取羅非魚全魚稱重后進行掃描反演，分析各組織對應信號強度，根據標準曲線計算組織重量，分析組織重量與魚體重相關性。

1.2.3數據分析 所有的統(tǒng)計數據均來自至少3次以上的重復實驗，使用軟件T1T2Inv反演軟件對采集的信號進行T1-T2二維譜分析，Microsoft Office Excel 2010進行計算，Graphpad Prism 5.0進行制圖。

2 結果與分析

2.1 羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織的離體定性分析

為了對羅非魚組織進行低場核磁共振T1-T2譜技術掃描反演定性分析，解剖羅非魚，取肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織，將4種組織分別放進核磁共振分析儀中利用低場核磁共振T1-T2譜技術掃描并反演成像，通過反演軟件計算得到各組織縱向弛豫時間T1分布、橫向弛豫時間T2分布以及縱向弛豫時間峰值(峰值表示信號達到最高峰對應的弛豫時間值)與橫向弛豫時間峰值比值(T1/T2)，結果見表1。根據4種組織單獨掃描反演成像結果(圖1)發(fā)現(xiàn)，4種組織的縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2有部分重疊；而肌肉組織T1/T2值為12.06±1.07，腹腔脂肪組織T1/T2值為2.05±0.65，肝臟組織T1/T2值為4.9±0.24和腸道組織T1/T2值為5.3±0.3。由此可知，僅根據4種組織的縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2不能將羅非魚肌肉組織、腹腔脂肪、肝臟組織和腸道組織徹底分離，但是根據4種組織的T1/T2值，能夠將肌肉組織和腹腔脂肪組織徹底分離；而由于肝臟組織和腸道組織的T1、T2重疊及T1/T2值相近，利用低場核磁共振T1-T2譜技術不能區(qū)分羅非魚肝臟組織和腸道組織。

表1 羅非魚組織定性分析Table 1 Qualitative analysis of tilapia tissues

注：圖中以不同顏色表示核磁共振信號幅度值。圖1 利用核磁共振T1-T2譜技術掃描羅非魚肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織反演圖Fig.1 The muscle tissue, abdominal adipose tissue, liver tissue, and intestinal tissue of tilapia were scanned by nuclear magnetic resonance T1-T2 spectroscopy

2.2 各組織混合模擬活體檢測二維1H LF-NMR定性可靠性

根據2.1的結果可知，在低場核磁共振T1-T2譜技術掃描下，羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、腸道組織和肝臟組織具有不同的組織特性。為了進一步驗證利用低場核磁共振T1-T2譜技術分離羅非魚組織的可靠性，解剖羅非魚(約2 kg)，取肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織和腸道組織，并混合，使用T1-T2聯(lián)合掃描分析。結果顯示，反演圖中有3個信號區(qū)域，分別為T1/T2=2.6，T1/T2=5，T1/T2=11(圖2)。根據表1中4種組織的T1/T2值，T1/T2=2.6區(qū)域為腹腔脂肪組織信號區(qū)域，T1/T2=5區(qū)域為肝臟或者腸道的信號區(qū)域，T1/T2=11區(qū)域為肌肉組織信號區(qū)域。這一結果顯示，采用低場核磁共振T1-T2聯(lián)合掃描能夠將肌肉組織和腹腔脂肪組織分離，而肝臟組織和腸道組織信號重疊，無法區(qū)分。由上述結果可知，利用低場核磁共振T1-T2譜技術能夠在混合組織中準確識別肌肉組織和腹腔脂肪組織。

注：圖中以不同顏色表示核磁共振信號幅度值。圖2 羅非魚肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織和腸道組織混合進行T1-T2聯(lián)合掃描Fig.2 Tilapia muscle tissue, abdominal adipose tissue, liver tissue and intestinal tissue were mixed for T1-T2 combined scanning

2.3 羅非魚肌肉、腹腔脂肪組織定量標準曲線測定

綜合2.1和2.2的結果，利用低場核磁共振T1-T2譜技術可以定性分離羅非魚的肌肉組織和腹腔脂肪組織。為了分析組織信號強度與組織重量之間是否存在聯(lián)系，取羅非魚組織梯度重量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)進行T1-T2聯(lián)合掃描后反演，分析區(qū)域信號強度與肌肉組織重量之間的關系，掃描結果顯示肌肉區(qū)域信號強度與肌肉組織重量線性相關，R2=0.974 3(圖3)；取羅非魚腹腔脂肪組織梯度重量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)進行T1-T2聯(lián)合掃描后反演，掃描結果顯示脂肪區(qū)域信號強度與脂肪組織重量線性相關，R2=0.965 0(圖3)。上述結果說明，利用低場核磁共振T1-T2聯(lián)合掃描可以定量分析羅非魚全魚肌肉組織含量及腹腔內脂肪組織含量。

圖3 羅非魚離體組織掃描組織區(qū)域信號大小與組織重量關系圖Fig.3 The relationship between signal size and tissue weight of tilapia in vitro tissue scanning

2.4 低場核磁共振T1-T2譜技術分析在羅非魚全魚中的實際應用

根據前述結果，低場核磁共振T1-T2譜技術能夠在離體條件下對羅非魚肌肉組織和腹腔脂肪組織進行定性和定量分析。為了驗證低場核磁共振T1-T2譜技術在羅非魚活體中應用的可行性，選取初始體重為(0.6±0.05) g的羅非魚進行為期2周的養(yǎng)殖實驗，養(yǎng)殖實驗結束后對羅非魚稱重，并利用低場核磁共振T1-T2技術掃描羅非魚全魚并反演成像。掃描結果發(fā)現(xiàn)，反演圖中出現(xiàn)2個信號區(qū)域，一個信號區(qū)域T1/T2值為12，另一個信號區(qū)域T1/T2值為5(圖4)。結合組織定性結果(表1，圖1)可知，T1/T2值=12的信號區(qū)域為肌肉組織信號區(qū)域，T1/T2值=5的信號區(qū)域為肝臟組織和腸道組織混合信號區(qū)域。從全魚掃描反演圖中沒有采集到腹腔脂肪組織信號。全魚掃描反演結果說明利用低場核磁共振T1-T2技術可以從羅非魚全魚中分離肌肉組織，由于肝臟組織和腸道組織T1、T2部分重疊及T1/T2值相近，利用核磁共振T1-T2技術無法分離肝臟組織和腸道組織信號區(qū)域。

注：圖中以不同顏色表示核磁共振信號幅度值。圖4 羅非魚全魚T1-T2聯(lián)合掃描反演成像圖Fig.4 Tilapia T1-T2 combined scanning inversion image of whole fish

為了驗證組織定量結果的可靠性，利用相關反演軟件對肌肉組織信號區(qū)域信號強度進行計算，并根據定量相關性曲線計算肌肉組織重量，將計算得到的肌肉組織重量與羅非魚體重進行相關性分析(圖5)。相關性分析結果顯示，根據信號強度計算得到羅非魚肌肉組織重量與羅非魚體重有較好的相關性(R2=0.806 9)。由此可知，利用低場核磁共振T1-T2技術能夠分離羅非魚全魚肌肉組織，并對羅非魚全魚肌肉組織進行定量分析。

圖5 計算所得肌肉組織重量/羅非魚體重Fig.5 Calculated muscle mass/tilapia weight

3 討論

核磁共振技術具有快速無損檢測的特點，被廣泛應用于各研究領域。利用核磁共振技術對肌肉組織和脂肪組織的分析在動物實驗中已有報道，如根據組織中氫原子核磁共振特性不同和密度不同，利用核磁共振成像測量小鼠的脂肪量和肌肉量[21]；利用不同組織在恒定磁場中對射頻信號的反應不同，結合低場核磁共振技術及最小二乘回歸法和主成分回歸法，建立脂肪和瘦肉含量預測模型[22]；利用時域核磁共振(time-domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR)技術檢測小鼠體內脂肪含量，分析小鼠肥瘦比[2-3]；水產動物營養(yǎng)研究中有利用核磁共振成像技術分析檢測水產動物脂肪體積相關報道[3-4,20]。但目前利用低場核磁共振T1-T2譜技術定性和定量分析魚類各組織含量尚未見相關報道。

本研究利用低場核磁共振T1-T2譜技術對羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織進行了定性分析，并通過混合上述4種組織模擬活體檢測進行了驗證，表明利用低場核磁共振T1-T2譜技術能夠分離肌肉組織和腹腔脂肪組織，但是無法分離肝臟組織和腸道組織。隨后對肌肉組織和腹腔脂肪組織進行了定量分析模型建立，發(fā)現(xiàn)組織信號大小與組織重量有很好的相關性，其中，肌肉組織相關性R2=0.974 3，腹腔脂肪組織相關性R2=0.965 0。為了驗證低場核磁共振T1-T2譜技術在羅非魚活體中應用的可行性，利用低場核磁共振T1-T2技術掃描羅非魚全魚，發(fā)現(xiàn)能夠采集到肌肉組織、肝臟組織和腸道組織信號，但肝臟組織和腸道組織信號無法分離。對于肌肉組織，利用反演軟件計算肌肉組織區(qū)域信號強度并跟據定量曲線計算肌肉組織重量，進一步發(fā)現(xiàn)計算所得肌肉組織重量與羅非魚全魚有一定的相關性(R2=0.806 9)。

本研究在全魚中沒有采集到腹腔脂肪組織信號，可能是因為羅非魚太小，腹腔脂肪組織量太低，在魚類養(yǎng)殖生產中利用低場核磁共振T1-T2譜技術測量魚體脂肪含量具有可行性。臟體比是指魚類內臟占魚體比重，臟體比反映魚類營養(yǎng)和健康狀態(tài)[24]，雖然低場核磁共振T1-T2技術無法分離肝臟組織和腸道組織，但是可以反映臟體比的大小。與魚類營養(yǎng)研究中的形體指標檢測和體成分分析法相比，低場核磁共振T1-T2譜技術具有快速無損以及可重復、動態(tài)檢測魚體組織含量的優(yōu)勢。

本研究在活體檢測過程中發(fā)現(xiàn)沒有采集到腹腔脂肪組織信號，需要進一步驗證其應用可行性，包括改變羅非魚規(guī)格、構建增脂模型等。此外，需要進一步使用添加劑改變羅非魚體內肌肉量，驗證檢測利用低場核磁共振T1-T2譜技術定量肌肉組織準確性與靈敏性；而且，本研究僅在羅非魚中進行，在其他魚類或者動物中的應用也值得探究。