趙杰,張偉杰,陳瑤,項(xiàng)清芳,趙婷,茆廣華,馮偉偉,仰榴青*

1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

蜂蛹(bee pupa)為胡蜂、黃蜂、黑蜂、土蜂等野蜂的幼蟲和蛹，蜂蛹含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有增進(jìn)食欲、改善睡眠、增強(qiáng)體質(zhì)、提高機(jī)體免疫力等功效[1]。蜂蛹中蛋白質(zhì)含量達(dá)35%～45%，且含有賴氨酸、蘇氨酸和亮氨酸等8種必需氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的天然蛋白質(zhì)資源[2]。蜂蛹多肽具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性。研究表明，蜂蛹多肽純化組分Ⅳ可較好的清除DPPH·自由基、ABTS+·自由基、超氧陰離子和羥基自由基，同時(shí)具有螯合Fe2+的能力，說明蜂蛹多肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力[3]。胡福良等[4]研究蜂蛹對小鼠S180腫瘤生長的抑制作用，結(jié)果表明，蜂蛹的抑瘤率為64.37%，能顯著延長S180腹水癌荷瘤小鼠的存活期。何娟等[5]采用環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型，研究了高、中、低3個(gè)劑量的雄蜂蛹多肽的免疫活性，結(jié)果表明，高劑量雄蜂蛹多肽可明顯提高環(huán)磷酰胺模型小鼠的白細(xì)胞數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)和有核細(xì)胞數(shù)，并能明顯提高有核細(xì)胞的DNA合成，表明雄蜂蛹多肽提取物對小鼠具有一定的免疫增強(qiáng)作用。但關(guān)于蜂蛹多肽純化組分的體外免疫調(diào)節(jié)活性的研究尚未見報(bào)道。

免疫應(yīng)答是指機(jī)體受抗原性物質(zhì)刺激后，免疫細(xì)胞發(fā)生一系列反應(yīng)以排除抗原性異物的過程。巨噬細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的重要成員之一，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著較為重要的作用，如免疫防衛(wèi)和維穩(wěn)等，在免疫應(yīng)答過程中，巨噬細(xì)胞是最先做出反應(yīng)的細(xì)胞種類之一[6]。被激活的巨噬細(xì)胞具有吞噬能力，并通過分泌各種免疫活性物質(zhì)，加速細(xì)胞的免疫反應(yīng)[7-8]。巨噬細(xì)胞RAW264.7是被用來研究免疫調(diào)節(jié)的常用細(xì)胞株[9]。

免疫調(diào)節(jié)劑是通過增加、減少或修改機(jī)體的免疫反應(yīng)來改變先天免疫和獲得性免疫體系的一類物質(zhì)[10]，蜂蛹多肽是將天然蛋白質(zhì)酶解得到的，對機(jī)體無毒副作用，因此，對蜂蛹多肽免疫調(diào)節(jié)活性的研究具有重要意義。本課題組在前期研究中經(jīng)酶解、純化獲得了一種蜂蛹多肽純化組分BPP-21(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，本研究通過考察BPP-21對巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞活力、吞噬能力、細(xì)胞因子分泌能力、NO分泌能力和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，來探究蜂蛹多肽的免疫調(diào)節(jié)活性，以期為研究與開發(fā)蜂蛹多肽免疫調(diào)節(jié)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BPP-21是本課題組在前期研究中由堿性蛋白酶水解蜂蛹蛋白、經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-25凝膠柱分離純化得到的純化組分(數(shù)據(jù)未發(fā)表)；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；凝膠電泳試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)酶聯(lián)免疫試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自合肥博美生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NO、細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Synergy H4型多功能酶標(biāo)儀(美國Biotek儀器有限公司)；MACO-18AIC型孵箱(日本三洋公司)；SW-CJ-IFB型超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán))；37XC倒置生物顯微鏡(上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)流程

細(xì)胞復(fù)蘇：將RAW264.7細(xì)胞的凍存管從-80 ℃冰箱中取出，將凍存管中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，添加少量培養(yǎng)液，1 500 r·min-1離心5 min，去除上清液，再加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，混勻后移入培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：在超凈臺中棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入含10% FBS DMEM培養(yǎng)基，混勻后吸取細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中，搖勻，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存：取對數(shù)生長期細(xì)胞，在超凈臺中棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，再加入含10% FBS高糖培養(yǎng)基，吹打均勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，去除上清液，加入凍存液，混勻后立即吸入凍存管中，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

選用正常傳代的RAW264.7巨噬細(xì)胞，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為1 mL細(xì)胞懸液中含有2×105個(gè)細(xì)胞，取滅菌的96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞生長狀況，若細(xì)胞完全貼壁生長，則移除細(xì)胞培養(yǎng)液，空白組每孔加入100 μL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μL不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液，模型對照組每孔加入100 μL 10 μg·mL-1脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液[11-13]，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24、48 h后，觀察細(xì)胞生長狀況，若生長狀況良好，每孔加入20 μL 1 mg·mL-1MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，待完全溶解后于570 nm處測定OD值。

1.5 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

細(xì)胞的選擇、密度的調(diào)整、加樣的濃度與方式以及細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.4。培養(yǎng)24 h后，取出96孔板，小心棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 0.05%中性紅溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后，棄去上清液，用PBS溶液清洗3遍，每孔再加入150 μL細(xì)胞裂解液，于4 ℃靜置2～3 h，待細(xì)胞完全裂解后于540 nm處測定OD值。

1.6 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ量的影響

調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 mL細(xì)胞懸液中含有2×105個(gè)細(xì)胞，接種于24孔板，每孔加500 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，小心棄去上清液，空白組每孔加入500 μL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入500 μL不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液，模型對照組每孔加入500 μL 10 μg·mL-1LPS溶液。培養(yǎng)24 h后，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書要求測定各細(xì)胞因子水平。

1.7 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌NO量的影響

細(xì)胞的選擇、密度的調(diào)整、加樣的濃度與方式和細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.6。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取出24孔板，收集上清液，按照NO檢測試劑盒要求測定NO含量。

1.8 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 mL細(xì)胞懸液中含有2×105個(gè)細(xì)胞，接種于6孔板，每孔加2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，小心棄去上清液，空白組每孔加入2 mL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入2 mL不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液，模型對照組每孔加入2 mL 10 μg·mL-1LPS溶液。培養(yǎng)24 h后，小心棄去上清液，用PBS溶液洗3遍，每孔加入300 μL細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞SOD和MDA的檢測試劑盒測定SOD活力和MDA含量。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞活力通常采用MTT法進(jìn)行檢測，圖1為不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21及10 μg·mL-1LPS分別作用6、12、24和48 h對細(xì)胞活力的影響。由圖1可見，與空白組相比，BPP-21在不同濃度下作用6、12、24和48 h對細(xì)胞活力均無顯著影響。結(jié)果說明BPP-21不會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，造成細(xì)胞凋亡。

注：不同小寫字母表示同一作用時(shí)間內(nèi)不同處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of BPP-21 on the viability of RAW264.7 cells

2.2 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、維持、宿主防御等方面起著至關(guān)重要的作用[14]，其吞噬功能是機(jī)體最重要的非特異性免疫反應(yīng)之一。圖2為BPP-21對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響。與空白組和LPS組相比，在25～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，BPP-21顯著提高了巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P<0.05)。說明BPP-21可激活巨噬細(xì)胞，顯著增強(qiáng)其吞噬能力。

2.3 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ水平的影響

當(dāng)機(jī)體受到炎癥損傷和外在病原體攻擊時(shí)，會引起細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子?；罨木奘杉?xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，如TNF-α、IL-2和IFN-γ[15-16]。圖3為BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌 IL-2、TNF-α和IFN-γ的影響。結(jié)果表明，與空白組相比，BPP-21可一定程度上促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ，BPP-21在25～200 μg·mL-1濃度下可顯著提高IL-2和TNF-α的分泌量(P<0.05)，在12.5～200 μg·mL-1濃度下可顯著提高IFN-γ的分泌量(P<0.05)；與LPS組相比，BPP-21在200 μg·mL-1濃度下顯著提高IL-2的分泌量(P<0.05)，在100和200 μg·mL-1濃度下可顯著提高TNF-α和IFN-γ的分泌量(P< 0.05)。說明BPP-21可激活RAW264.7細(xì)胞，使其IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌量顯著增加。

2.4 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌NO水平的影響

NO是一種細(xì)胞內(nèi)信號分子，不僅參與許多生理和病理活動，而且是巨噬細(xì)胞破壞細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的主要媒介。因此，NO可作為測定巨噬細(xì)胞活化的定量指標(biāo)[17]。圖4為BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響。結(jié)果表明，與空白組相比，BPP-21在12.5～200 μg·mL-1濃度下顯著增加了巨噬細(xì)胞NO的分泌量(P<0.05)；與LPS組相比，BPP-21在100和200 μg·mL-1濃度下顯著提高了NO的分泌量(P<0.05)。說明BPP-21可顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的作用。

2.5 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

SOD活力表示對自由基的清除能力，可評價(jià)抗氧化應(yīng)激能力[18]。MDA是最穩(wěn)定的次生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，它在細(xì)胞中引起毒性應(yīng)激，導(dǎo)致組織損傷，而且MDA已被用作細(xì)胞中氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，并已報(bào)道存在于多種食品中[19-20]。圖5為BPP-21對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響。與空白組和LPS組相比，在濃度為50～200 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞SOD活力顯著升高(P<0.05)；BPP-21對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)MDA的含量無顯著影響。說明BPP-21可不同程度提高RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD的活力，并對細(xì)胞無明顯氧化損傷作用。

注：不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.2 Effect of BPP-21 on the phagocytosis of RAW264.7 cells

注：不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ的影響Fig.3 Effects of BPP-21 on inducing IL-2, TNF-α, IFN-γ production of RAW264.7 cells

3 討論

本文研究了蜂蛹多肽純化組分BPP-21對RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫活性的影響。結(jié)果表明，在濃度12.5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，BPP-21對RAW264.7巨噬細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性作用，并顯著提高IFN-γ與NO的分泌量；在濃度25～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，顯著增加細(xì)胞吞噬能力、IL-2與TNF-α的分泌量；在濃度50～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，顯著提高細(xì)胞內(nèi)SOD的活力。說明BPP-21對RAW264.7巨噬細(xì)胞具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。

巨噬細(xì)胞作為吞噬細(xì)胞，廣泛分布于全身，在宿主防御中起著重要作用，通過其吞噬功能、細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)殺傷活性在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[21]?；罨木奘杉?xì)胞不僅能夠吞噬病原體，還可以分泌調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細(xì)胞信使，如炎性介質(zhì)NO、細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ。董曉澤[22]研究了日本黃姑魚皮活性肽對RAW 264.7細(xì)胞的免疫活性，結(jié)果表明，日本黃姑魚皮活性肽對RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力、NO分泌能力和TNF-α、IL-6、IL-12分泌能力的提高具有顯著的促進(jìn)效果。本研究表明BPP-21對RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力以及分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ和NO的能力具有顯著促進(jìn)作用，說明BPP-21具有較好的免疫活性。

注：不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響Fig.4 Effect of BPP-21 on the secretory NO of RAW264.7 cells

機(jī)體產(chǎn)生自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成MDA，MDA參與脂質(zhì)自由基的形成和氧的攝取，是內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化物的標(biāo)志[23]，測定MDA的量可間接反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，還能夠修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原自由基對人及動植物機(jī)體造成的損傷[24]。本研究表明BPP-21可提高RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD的活力，對MDA的含量無顯著影響，說明BPP-21對RAW264.7細(xì)胞無明顯氧化損傷作用，且可以修復(fù)受損細(xì)胞、恢復(fù)氧自由基對細(xì)胞的氧化損傷，對細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)活性。

注：不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5 BPP-21對RAW264.7細(xì)胞SOD和MDA的影響Fig.5 Effect of BPP-21 on SOD and MDA levels of RAW264.7 cells

本文主要研究了蜂蛹多肽純化組分BPP-21對RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫活性的影響，表明BPP-21具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，可為研究與開發(fā)蜂蛹多肽免疫調(diào)節(jié)劑提供理論基礎(chǔ)，后續(xù)將通過對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和iNOS mRNA表達(dá)量的影響；對MAPKs信號通路受體蛋白和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響對其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行深入研究。